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“从痰论治”方抑制肥大细胞活性减轻动脉粥样硬化斑块负荷的动物研究
作者:吴宗贵[1] 梁春[2] 
单位:上海市中西医结合心血管病研究所[1] 中国人民解放军海军军医大学长征医院[2]  
文章号:W109730  
2015/10/12 9:10:10    
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摘要: 目的:在制备的小鼠动脉AS斑块模型中,研究“从痰论治”方调控肥大细胞脱颗粒治疗AS斑块的作用。 方法:Apo-E-/-小鼠分别行左肾动脉狭窄和左颈动脉分支限流术,随机分为对照组、模型组、模型+阿托伐他汀组、模型+中药组。饲以高脂饲料喂养同时灌胃给药,每组10只。12周后,安乐死,取材。

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目的:在制备的小鼠动脉AS斑块模型中,研究“从痰论治”方调控肥大细胞脱颗粒治疗AS斑块的作用。365医学网 转载请注明
方法:Apo-E-/-小鼠分别行左肾动脉狭窄和左颈动脉分支限流术,随机分为对照组、模型组、模型+阿托伐他汀组、模型+中药组。饲以高脂饲料喂养同时灌胃给药,每组10只。12周后,安乐死,取材。心脏穿刺采集全血,离心后采用快速蛋白液相色谱仪检测小鼠血浆脂蛋白;胆固醇及甘油三酯液体单试剂检测盒(酶法)检测TC、TG水平;比色法测定血清类胰蛋白酶活性;定量PCR测定肥大细胞活化基因表达情况;主动脉根部切片HE、油红o及甲苯胺蓝染色观察组间斑块及肥大细胞情况。365医学网 转载请注明
结果:各组之间,中药组降低小鼠血浆TC水平效果更为明显,其LDL、及类胰蛋白酶活性显著下降。主动脉血管组织肥大细胞分泌相关基因与炎症因子TNF-α在各组之间存在显著差异。主动脉血管切片HE、油红o及甲苯胺蓝染色显示模型可加速动脉斑块形成,“从痰论治方”可降低动脉血管斑块负荷面积,减少肥大细胞在外膜聚集和脱颗粒,达到治疗动脉粥样硬化斑块的作用。365医学网 转载请注明
结论:“从痰论治”方可以减缓动脉粥样硬化斑块形成,其机制可能与其减少肥大细胞聚集、脱颗粒抑制炎症因子释放,降低血脂和晚期糖基化终产物水平相关。       365医学网 转载请注明
关键词:动脉粥样硬化;肥大细胞;从痰论治方;脱颗粒365医学网 转载请注明
    动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)斑块破裂继发血栓形成阻塞管腔是急性心血管事件发生的最主要病因,虽然斑块破裂的过程受许多因素影响,但近年研究显示分布于斑块血管外膜肥大细胞(mast cell,MC)脱颗粒以及所释放的活性物质[1, 2],在寒冷、情绪激动等应激因素所诱发的血管痉挛、血栓形成以及斑块破裂中发挥重要作用[3]。病理研究发现在死于心肌梗死病人的冠状动脉粥样硬化斑块破裂处存在大量肥大细胞,且大多被激活脱颗粒,这表明肥大细胞与斑块的破裂密切相关[4]。365医学网 转载请注明
    与西方医学对AS发生机制的解释不同,中医将AS归结为“痰瘀互结证”。痰浊和瘀血互为因果,相互影响,恶性循环。痰瘀互结既是AS病变的始动因子,又是AS进展中新的致病因子,因此,AS治疗关键在于活血化瘀、祛痰利湿[5]。活血化瘀能够降低血粘度、改善微循环;祛痰具有降低氧化应激反应、调节血脂以及消除血管炎性改变等功效。为此,我们选用上海长征医院心内科吴宗贵教授研制的“从痰论治方”作为研究对象,该复方制剂源于《金匮要略》的经典方剂并经改良。365医学网 转载请注明
1、材料与方法365医学网 转载请注明
    材料:健康SPF级6-8周龄雄性apo-E-/-小鼠:n=40,体重25±2g,由中国科学院上海药物研究所实验动物中心提供。从痰论治方胶囊:上海长征医院制剂室提供,规格0.35g/粒。阿托伐他汀:辉瑞公司。365医学网 转载请注明
1.1  动物模型制备与分组:365医学网 转载请注明
    模型构建[6]:首先行小鼠左颈动脉分支限流术,一周后行左肾动脉狭窄术,引发肾血管性高血压。术前和手术期间给予普通饮食喂养,术后2天开始给予高脂饲料喂养(热量组成:碳水化合物20.1%,脂肪59.8%,蛋白质20.1%)直至12周实验终点。将建模的apo-E-/-小鼠随机分为四组,每组10只,分为对照组(CON)、模型组(MOD)、模型+阿托伐他汀组(atorvastatin,ATO)和模型+中药组(Traditional Chinese Medicine,TCM)。其中,ATO组拟临床成人剂量40mg/d,换算成小鼠剂量为6mg·kg-1·d-1灌胃;TCM组拟临床成人剂量4.2g/d,换算成小鼠剂量为0.63g·kg-1·d-1灌胃;CON和模型组以等体积的生理盐水灌胃。12周后禁食,常规处死,取材检测。365医学网 转载请注明
1.2  主动脉大体油红染色及病理形态观察 :365医学网 转载请注明
    试验末,麻醉后处死小鼠,左心室入路,全身灌注肝素化PBS将动脉系统血液冲洗干净。自主动脉起始部仔细解离主动脉至腹主动脉的髂动脉分叉处,平铺于防脱载玻片上,4%多聚甲醛固定48小时,PBS漂洗固定后的主动脉,暗室下油红染色3小时,70%酒精分化直至对比明显。心耳下方切开小鼠心脏,分离主动脉根部,4%多聚甲醛固定24小时,30%蔗糖溶液脱水12小时,OCT胶包埋行冰冻切片,HE、油红染色观察血管病理形态变化。365医学网 转载请注明
1.3  血清脂质成分测定:365医学网 转载请注明
    试验末,禁食12小时,1%戊巴比妥腹腔麻醉小鼠,心脏穿刺采集全血,4°C,3000r·min-1,离心10min,取上清分装,单试剂检测盒(上海北加生化试剂有限公司)测定血清TC、TG水平。365医学网 转载请注明
1.4  类胰蛋白酶测定:365医学网 转载请注明
    取各组小鼠血清,按照参考文献[7]方法测定血清中类胰蛋白酶活性。将40uL待测样本加入1.5mL Tris-His缓冲液中,加入等体积Na-苯甲酰-DL-精氨酸-ρ-硝酰基苯胺二甲基亚砜溶液,3℃水浴,20min后30%乙酸终止反应,立即用紫外分光光度计取410nm波长测定吸光度,利用公式计算类胰蛋白酶活性:类胰蛋白酶活性(u/L)=△A×106×V/(△t×v×ε×L),其中△A为吸光值的差值,V为反应总体积,v为带测样品体积,ε为摩尔吸光系数,L为光程。365医学网 转载请注明
1.5  FPLC测定血浆脂蛋白水平:365医学网 转载请注明
    应用Waters 2695四元泵+PDA2996色谱仪,采用快速蛋白液相方法(FPLC)测定各组血浆样本中的脂蛋白分类及含量。配置缓冲盐流动相:NaCl 8g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.24g、Na2EDTA 1.861g、Na2HPO4 1.44g、NaN3 0.2g 溶于色谱用纯水(本实验用娃哈哈纯净水),PH调定至7.4,真空0.22um抽滤备用。上样及仪器设置情况:流速0.5ml/min、压力45psi、delta6psi,血浆样本60ul。记录图像时间为上样后30分钟至90分钟。365医学网 转载请注明
1.6  肥大细胞活性及炎症因子测定:365医学网 转载请注明
    主动脉根部冰冻切片,0.5%甲苯胺蓝酒精溶液染色,通过观察肥大细胞胞浆脱颗粒,计算脱颗粒的细胞数与肥大细胞总数的比值即脱颗粒的肥大细胞百分率。365医学网 转载请注明
各组主动脉血管样本采用q-PCR法测定肥大细胞分泌相关基因(LTC4S[10]、HDC[10]、Cma1[11]、Slpi[11]、MCP6[12]);血细胞样本测定炎症因子(TNF-α、IL6、IL10、TGF-β)。收集数据使用Bio-rad仪器自带CFX Manager软件分析。365医学网 转载请注明
1.7  统计学处理365医学网 转载请注明
   采用SPSS 11.5软件进行统计学分析,正态分布数据以x±s表示,两组间差异分析采用两独立样本t检验进行比较,多组间差异分析使用方差分析(ANOVA),偏态分布数据以中位数±四分位均数表示,分析采用秩和检验,检验水准(α)为0.05。365医学网 转载请注明
2、结果365医学网 转载请注明
    2.1  左肾动脉狭窄合并左颈动脉分支限流模型可以加速Apo-E-/-小鼠主动脉斑块形成365医学网 转载请注明
    2.2  各组小鼠主动脉病理改变比较  CON组动脉内膜较光滑,斑块负荷及管腔狭窄程度较轻,外膜未见明显肥大细胞聚集脱颗粒现象;MOD组内皮脱落且不连续,内皮下可见泡沫细胞和胆固醇结晶堆积,管腔狭窄明显,外膜肥大细胞脱颗粒显著;用药组上述病理损伤均不同程度减轻,其中TCM组斑块明显减少,外膜肥大细胞未见大量聚集。365医学网 转载请注明
    2.3  各组体重、血脂、类胰蛋白酶、晚期糖基化终产物及血浆脂蛋白比较  体重:手术可导致小鼠体重明显下降(P0.05),同时观察到ATO组小鼠体重下降最明显;类胰蛋白酶:手术可使各组血清类胰蛋白酶水平显著升高,但TCM组降低效果明显(P0.05);血脂:总胆固醇TCM组较ATO组下降更加显著(P0.05),总甘油三酯两药物干预组之间无显著差异(P0.05);TCM组肥大细胞脱颗粒百分比较其他组有显著降低(TCM:20.9%±5.9%vs MOD:55.3%±12.6%,P<0.05)。血浆脂蛋白:ATO组和TCM组可以降低LDL水平(P0.05),各组之间HDL水平无明显差异(P0.05)。365医学网 转载请注明
   2.4  各组小鼠主动脉肥大细胞相关基因及炎症因子表达情况  与CON组相比,手术各组肥大细胞分泌相关基因均有不同程度的激活(P0.05);TCM组相较ATO组,在分子水平中可以显著抑制肥大细胞激活(P0.05)。与Con组相比,手术各组血液中炎症因子均有不同程度的激活(P0.05);其中促炎因子TNF-α水平,TCM组较ATO组显著降低(P0.05),IL6、IL10、TGF-β水平ATO组和TCM组无明显差异(P0.05)。365医学网 转载请注明
3、讨论365医学网 转载请注明
    Apo-E-/-小鼠是AS最常选用的模型动物之一,本实验采用Jin[6] 等所构建的小鼠动脉易损斑块模型通过肾动脉狭窄和颈动脉分支结扎的方法,可构建颈动脉易损斑块,同时促进主动脉斑块的形成。365医学网 转载请注明
    肥大细胞是机体分泌最活跃的细胞之一,主要通过脱颗粒,释放颗粒内容物产生多种活性介质发挥作用,目前已证实肥大细胞活化后,可分泌组胺、糜蛋白酶、类胰蛋白酶等40多种介质。其中Leukotriene C4synthase[10](LTC4S)、Histidine decarboxylase[10](HDC)是白三烯和组胺合成的关键酶,mast cell chymase[11] (CMA1)、secretory leukocyte peptidase inhibitor[11] (Slpi)、Mast Cell Protease 6[12](MCP6)是参与基质金属蛋白酶(MMP)活性以及细胞外基质重塑的重要蛋白。晚期糖基化终产物是非酶糖基化反应的终末产物,动脉粥样硬化的发生、发展跟体内AGEs的慢性蓄积有着密切的关系。本研究结果显示“从痰论治方”具有减少主动脉斑块形成;抑制斑块血管外膜肥大细胞聚集和脱颗粒;下调LTC4S、HDC、Cma1、MCP6等水平;下调炎症因子TNF-α,降低血总胆固醇和晚期糖基化终产物的作用。 365医学网 转载请注明
    中医将AS总结为“痰瘀互结证”,斑块可视作中晚期痰浊瘀血相凝之结块,上海长征医院吴宗贵教授研制的“从痰论治方”是由瓜蒌、薤白等多种中药处方联合制作而成,其具有活血化瘀、祛痰利湿的功效。本实验验证了“从痰论治方”在一定程度上抑制肥大细胞在斑块血管外膜聚集脱颗粒,降低相关炎症发生,为中医治疗动脉粥样硬化提供了新的思路。365医学网 转载请注明
参考文献365医学网 转载请注明
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作者简介
吴宗贵
单位:上海市中西医结合心血管病研究所
简介:  教授 博士生导师 现任上海市中西医结合心血管病研究所所长。   任中国中西医结合学会心血管病专
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