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PCSK9及PCSK9抑制剂的研究进展
作者:王文广[1] 丛洪良[2] 
单位:天津医科大学[1] 天津市胸科医院[2]  
文章号:W110902  
2015-12-19 11:07:15    
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  冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary Atherosclerotic Heart Disease,CAD)目前是人类致死、致残的主要原因之一,他汀类药物在防治心血管疾病方面的疗效显著,但是即便给予推荐的最大剂量的他汀仍有60%-70%的心血管患者的血脂持续处于较高水平[1],以及由于担心高剂量他汀会引起新发糖尿病及增加肌病的风险,人们在不断寻求治疗动脉粥样硬化的新药物。

  冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary Atherosclerotic Heart Disease,CAD)目前是人类致死、致残的主要原因之一,他汀类药物在防治心血管疾病方面的疗效显著,但是即便给予推荐的最大剂量的他汀仍有60%-70%的心血管患者的血脂持续处于较高水平[1],以及由于担心高剂量他汀会引起新发糖尿病及增加肌病的风险,人们在不断寻求治疗动脉粥样硬化的新药物。人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase Subtilisin/kexin type 9,PCSK9)发现于2003年,同年,法国学者Abifadel等[2]在家族性常染色体显性高胆固醇血症(Autosomal dominant hypercholesterolemia,ADH)患者中发现引起高胆固醇血症的不是低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)基因或apoB基因突变,而是PCSK9功能获得型基因突变。随着研究的深入,人们发现PCSK9在稳定血脂方面起着重要的调节作用,PCSK9 通过增加LDLR的降解升高血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-cholesterol,LDL-c)水平,与动脉粥样硬化的发生发展关系密切,因此,抑制PCSK9的活性已成为降低LDL-c用于药物开发的一个新的有潜力的治疗靶点,本文对PCSK9的作用机理、基因突变产生的效应、与动脉粥样硬化的关系及PCSK9相关的临床试验进展做一综述。365医学网 转载请注明
1、PCSK9的研究进展365医学网 转载请注明
  1.1 PCSK9的结构特点365医学网 转载请注明
  2003年,PCSK9由神经科学家Seidah首次发现并命名。PCSK9 是可溶性的内源性丝氨酸蛋白酶,为哺乳动物前蛋白转化酶家族的成员之一,主要在肝脏合成,在肠道、肾脏及脑也有低水平的表达[3]。PCSK9基因位于人类染色体1p32.3,长22Kb,包含12个外显子和11个内含子[4],编码包含692个氨基酸残基的PCSK9酶原,与其他前蛋白转化酶家族成员一样,含有4个结构域,即信号肽结构域,原结构域,枯草溶菌素样催化域,和可变的羧基末端结构域,但其C末端结构域中有一个折叠在其他枯草溶菌素丝氨酸蛋白酶中未出现过。365医学网 转载请注明
  1.2 PCSK9与LDLR365医学网 转载请注明
  和LDLR一样,PCSK9在启动区含有一个胆固醇调节元件(sterol regulatory element,SRE) ,因此PCSK9和LDLR的表达都主要接受胆固醇调节元件结合蛋白SREBPs-2的调节[5]。胞内胆固醇水平降低时,激活胞浆中的SREBPs-2并使之发生核转移,与LDLR及PCSK9的启动子SRE结合,同时激活LDLR及PCSK9基因转录,LDLR通过内吞血浆中LDL-c提升胞内胆固醇水平,PCSK9作为一种负反馈机制限制LDLR的作用。365医学网 转载请注明
    PCSK9作为一个分子伴侣通过两种途径指引LDLR降解:其一是初期的PCSK9与LDLR在转运高尔基体的管状分泌部结合并在囊泡中运送至溶酶体[6],其二是分泌的PCSK9与细胞膜表面LDL-R表皮生长因子样的结构域(EGF-A)结合,形成LDLR-LDL-PCSK9复合物内化后在囊泡中运送至溶酶体。PCSK9 与 LDLR结合是pH依赖性的,两者的亲和力在pH 5.3的环境中比 在pH 7.4时至少高150倍[7],故在溶酶体的酸性环境中PCSK9与LDLR不能解离,两者共同在溶酶体降解而使LDLR不能循环到细胞膜再次利用[8]。采用PCSK9单克隆抗体阻断PCSK9与细胞膜表面LDLR的 EGF-A结合取得明显的降脂效果,说明后一途径在人类肝细胞维持LDLR水平上起主导作用[9]。因此,PCSK9对SREBPs途径所活化的LDLR是一种对抗机制,生理状态下PCSK9-LDLR之间的平衡调节胆固醇进入细胞并保持细胞内胆固醇浓度的稳定。365医学网 转载请注明
  1.3 PCSK9与LDL 365医学网 转载请注明
    血浆中的LDL-c主要通过LDLR内吞清除,PCSK9通过增加LDLR的降解减少LDL-c的清除而使血浆LDL-c水平增高。另外,Kosenko等[10]研究表明正常血脂水平空腹情况下循环中的超过30% 的PCSK9通过蛋白-蛋白相互作用与LDL颗粒上的apoB100结合,这种结合会反过来抑制PCSK9与细胞膜表面的LDLR结合。而且值得一提的是,PCSK9与LDL的亲和力(KD=5-25nM)[11]明显高于PCSK9与LDLR的亲和力(KD=170-628nM)[10];同时,PCSK9在血浆中的浓度远低于LDL,所以相比LDLR,LDL与PCSK9的结合占据主导权。当血浆LDL / VLDL比值增加以及空腹血浆PCSK9水平下降时,血浆中的PCSK9与LDL结合成为结合态而失活,从而提高肝脏清除LDL的能力。较高的PCSK9浓度时由于与LDL相对低的亲和力(KD 300nM),LDL对PCSK9活性的负反馈失调。虽然在高胆固醇血症时PCSK9与LDL结合的百分比更高,但是由于肝脏分泌的PCSK9增加,循环中仍然有较多的PCSK9处于游离的活化状态[10]。尽管曾经观察到在LDL水平过高时可几乎完全阻断PCSK9与LDLR的结合,PCSK9仍可能会通过协调受体或在细胞表面分子的帮助下结合到LDLR上[12]或者PCSK9本身形成二聚体或三聚体提高与LDLR的结合能力[13]。 365医学网 转载请注明
  1.4 PCSK9与apoB365医学网 转载请注明
    Rashid等[14]对人类肠细胞的研究发现,PCSK9处理24小时后的肠细胞分泌的apoB48 和apoB100 增长 40% - 55%, 而短期PCSK9基因表达的缺失可以逆转这种效应。PCSK9使apoB mRNA表达上调1.5倍从而使apoB 的分泌量增加,并通过LDLR 依赖的和非LDLR 依赖的途径增加apoB蛋白的稳定性。365医学网 转载请注明
  1.5 PCSK9的影响因素365医学网 转载请注明
    正常情况下,血浆PCSK9水平在空腹时下降,在餐后增高,呈双向变化,与肝脏胆固醇合成呈镜像改变[15]。空腹PCSK9与LDL-c及血浆甘油三酯正相关,细胞内低胆固醇水平及他汀类药物所产生的肝细胞内胆固醇下降均可上调PCSK9的基因表达,而PCSK9通过增加LDLR的降解部分抵消了他汀类药物的生物学效应[16]。 365医学网 转载请注明
    渥太华心脏基因组研究发现心肌梗死患者的PCSK9水平高于无心肌梗死的CAD患者;埃默里心脏病生物资料库研究也得出了同样的结论。由于既往是否有心肌梗死对CAD患者PCSK9无影响,故该两项研究提示PCSK9在心肌梗死发生前或发生过程中表达增加[17]。另外,性别、年龄、饮食、运动、激素水平(生长激素、雌激素)均对PCSK9的合成、分泌有影响,疾病状态如糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖、甲状腺疾病、肾脏疾病、感染等及药物应用也会对PCSK9产生影响[18]。365医学网 转载请注明
2. PCSK9基因突变365医学网 转载请注明
    目前发现的PCSK9基因变异共163种,其中93.9%为替换突变,4.9%为插入突变,1.2%为缺失突变 [19]。PCSK9基因突变可以引起高胆固醇血症及低胆固醇血症,个别突变对胆固醇代谢没有影响,如A168E等。基因突变发生的频率与种族有关,同种突变在不同种族中产生的表型也不尽相同。例如PCSK9 R46L变异在白人中的少见等位基因频率(Minor allele frequencies,MAF)约3.2%,而在非洲裔美国人中的MAF仅 0.6%[20];PCSK9142X 和 PCSK9679X在非洲裔美国人MAF分别为0.8 %和1.8 %,而在9537 例白人中仅出现2例 PCSK9142X 和4 例 PCSK9679X 等位基因[21];PCSK9A443T 突变在非洲裔美国人中MAF为 9.4%,而白种人MAF仅为0.048%。PCSK9 c.61_63insCTG 变异在白种人[22]和日本人[23]中的 MAFs相似,分别为11%和15%,但在白种人中表现为更低的LDL-c。365医学网 转载请注明
  2.1 功能获得型基因突变 365医学网 转载请注明
    2003年Abifadel 等[2]首次发现PCSK9S127R和PCSK9F216L基因突变所致的ADH表型。PCSK9与ADH相关的功能获得型突变MAF较低,大约占ADH的 2.3%[24]。日本的资料显示PCSK9突变在高胆固醇血症中出现的MAF约5%[25],有学者认为PCSK9杂合子突变在西方国家MAF可能更高,但是因为这种ADH3表型温和而很多患者没有作为ADH进行基因检测。Naoumova等[26]发现PCSK9突变所致的ADH3与LDLR基因突变导致的ADH1类似,但变异更大,高血脂程度相对较轻,对胆酸螯合剂及他汀类等降脂药物的反应相对较好;另外, LDLR基因突变纯合子比PCSK9基因突变纯合子有更高的甘油三酯水平。365医学网 转载请注明
    PCSK9S127R主要通过增加与细胞膜表面LDLR的亲和力而增加其降解[27];PCSK9F216L突变在不同pH值时均不改变与LDLR结合的亲和力;PCSK9 D374Y在不同pH值的环境中与LDLR均有更高的结合能力 [28]。以上情况说明PCSK9功能获得型突变在提高PCSK9活性上存在多重机制。有些突变功能获得的机制尚不明确,需进一步研究。 365医学网 转载请注明
    对功能获得型突变PCSK9E670G的研究发现,患者LDL-c明显增高,动脉粥样硬化的程度也明显增加,心肌梗死、缺血性脑卒中等心脑血管事件的发生率增加 [29]。Slimani等[30]通过队列研究发现PCSK9E670G等位基因在CAD患者出现的频率明显高于非CAD患者,PCSK9E670G在缺血性脑血管病亚组MAF也较对照组高。CAD患者中PCSK9E670G携带者血浆总胆固醇及LDL-c明显高于非携带者,明显增加了两支或三支冠状动脉狭窄的患病风险及冠状动脉病变的严重程度。365医学网 转载请注明
    目前已经发现的功能获得型突变还有[19]V4I、E32K、E54A、R104C、S127R、D129N、D129G、R215H、F216L、R218S、R357H、D374Y、D374H、N425S、R469W、R496W、A514T、A522T、H533R、V624M及R306S等[31]。365医学网 转载请注明
  2.2 功能缺失型基因突变 365医学网 转载请注明
    功能缺失型突变减少LDLR降解,通过LDLR介导的LDL-c内吞从而增加在血浆中的清除,降低血浆LDL-c和降低心血管事件的发生率。目前发现的功能缺失型突变形式有[19]:R46L、Ala68fsLeu82X、T77I 、R93C、R97DEL、G106R、V114A 、Y142X、Q152H、N157K、Q219E、G236S、A239D、L253F、N354I 、H391N、W428X、R434W、I474V、G452D、S462P、Q554E、P616L、S668R、C679X及Q152H等[32]。365医学网 转载请注明
    血浆中PCSK9的水平下降直接可引起LDL-c水平的下降,C679X、Y142X、Q152H和R46L突变血浆中的PCSK9水平均明显低于非携带者。而I474V突变PCSK9的水平有下降趋势,但无统计学差别,但是这种变化却引起LDL-c的明显下降。相反的,Mayne等[33]通过研究信号肽c.61_63insCTG (即L10Ins) 和前结构域A53V共变异发现,在白种人PCSK9 L10A53V携带者的LCL-c水平明显降低而血浆中PCSK9却没有减少,说明PCSK9 L10A53V通过其他机制导致 PCSK9功能失活。365医学网 转载请注明
    Huang等[34] 发现L253F, C679X, Y142X及A443T等位基因携带者在38-50岁期间颈动脉内膜中层厚度及冠状动脉钙化程度均低于非携带者,提示长期的低胆固醇水平的益处。Cohen等[21]通过对携带C679X,Y142X和R46L突变的非洲裔美国人研究发现,携带者LDL-c水平下降28%,而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)水平两组无差别;非携带者随访15年CAD事件发生率9.7%,携带者CAD事件发生率仅为1.2%,其CAD的患病风险下降达88%。365医学网 转载请注明
  2.3 联合基因突变365医学网 转载请注明
    LDLR和PCSK9同时发生突变时可以出现更严重的ADH的表型。Pisciotta等[35]报道了2例临床诊断为纯合子ADH患者,但一例基因检测为LDLRE228K杂合子突变及PCSK9R496W突变,另一例为LDLR Y419X无义突变及PCSK9 N425S突变。这些患者的表现说明PCSK9突变和LDLR突变对LDL-c代谢有相加作用。365医学网 转载请注明
3、PCSK9对动脉粥样硬化的影响365医学网 转载请注明
    PCSK9通过增加肝脏LDLR在胞内体和溶酶体的降解在脂质代谢中起到关键的调节作用。小鼠过表达野生型PCSK9和PCSK9功能获得型基因突变都可以导致肝脏LDLR明显减少[36],血浆胆固醇水平显著增高,与之相反,PCSK9基因敲除小鼠肝脏的LDLR表达增加,血浆LDL-c明显下降[37]。临床上未经治疗的纯合子的家族性高胆固醇患者在20岁甚至在10岁前就可以有明显的动脉粥样硬化而表现为CAD。而PCSK9功能缺失型基因突变表现为明显的低胆固醇血症,同时心血管风险明显降低[38],说明PCSK9通过调节胆固醇水平而与动脉粥样硬化关系密切。365医学网 转载请注明
    另外有证据表明PCSK9还可以通过其他机制加速动脉粥样硬化的进展。有研究[39]表明PCSK9在平滑肌细胞、内皮细胞表达,而在巨噬细胞及单核细胞不表达,并证实平滑肌细胞能够分泌有功能的活性的PCSK9并能减少巨噬细胞的LDLR表达,提示PCSK9可能在泡沫细胞的形成及动脉粥样硬化发生中起直接作用。PCSK9过表达还参与细胞的凋亡、炎症与增殖。脂多糖、酵母聚糖等炎症刺激可明显诱导PCSK9的表达,使LDL-c水平明显增加;另外,氧化的LDL(ox-LDL)可以通过刺激巨噬细胞分泌IL-1α、IL-6、TNF-α等炎症因子增加PCSK9的表达[40]。365医学网 转载请注明
    Kühnast等[41]通过动物实验发现,PCSK9单克隆抗体alirocumab(REGN727/ SAR236553)呈剂量依赖性的降低动脉粥样硬化的面积(71%-88%)及严重性,联合应用阿托伐汀时效应增加(89% -98%);Alirocumab减少单核细胞的招募,通过增加平滑肌细胞和胶原、降低巨噬细胞浸润、减少坏死核心的形成从而改善病变的构成。这从另一方面说明PCSK9通过多种机制参与动脉粥样硬化的形成。另外,Slimani等[42]通过多元回归分析还发现L10等位基因与CAD发生风险下降相关,并使冠状动脉病变严重程度降低,L10的这些作用似乎独立于降低LDL-c的作用之外,提示PCSK9有直接导致动脉粥样硬化的作用。365医学网 转载请注明
4、PCSK9抑制剂的研究进展365医学网 转载请注明
    血脂异常是缺血性心血管疾病发生发展的一个关键的风险因素,虽然他汀类药物能够有效降低血浆胆固醇,但是仍有部分患者血脂不能有效控制以及不能耐受。而其他的替代药物如贝特类、胆酸螯合剂和烟酸类药物疗效有限,这些都促使人们寻找更好、更安全的新型药物。胆固醇酯转运蛋白(CETP)抑制剂、微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP) 抑制剂及载脂蛋白CⅢ(Apo CⅢ) 抑制剂均在研究中,PCSK9抑制剂作为降低LDL-c的新药物已经受到广泛关注,而且是目前最有希望的一类药物。PCSK9抑制剂包括单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAb)、反义寡核苷酸、小干扰RNA、抑制性的抗体模拟物及EGF-A模拟性多肽,部分药物正在进行临床试验(见表1),而目前最被看好的是mAb。365医学网 转载请注明
表一:PCSK9相关药物进展[43] 365医学网 转载请注明
  在Ⅰ期临床试验中,alirocumab 50mg,100mg和150mg在阿托伐他汀治疗的基础上与对照组相比使LDL-c再降低39.2%,53.7%和61% [44],Ⅱ期临床试验NCT01288443[45]入选接受小-中剂量阿托伐他汀(10-40mg/d)的患者,alirocumab 50 mg, 100 mg, 及150 mg使LDL-c平均下降分别为40%,64%, 和72%,说明阿托伐他汀不影响该药物的剂量反应。Ⅱ期临床试验NCT01288469[46] 入选了先接受阿托伐他汀10mg/d治疗7周并在准备期LDL-c>100mg/dl的患者92例,阿托伐他汀80mg/d或阿托伐他汀10mg/d联合alirocumab治疗8周分别使LDL-c下降 73%和66%, 而安慰剂组LDL-c仅降低 17%。GAUSS研究[47]入选了160例他汀不耐受的高胆固醇血症患者,平均LDL-c193 mg/dL。evolocumab单药280mg, 350mg, 和420 mg治疗12周分别使LDL-c平均下降41%, 42%和 51%;420 mg evolocumab联用10 mg依折麦布使LDL-c下降 63%;依折麦布加安慰剂组下降15%。另外,在MENDEL 研究和LAPLACE-TIMI 57两项临床试验中evolocumab也取得了类似的效果。365医学网 转载请注明
    Ⅲ期临床试验(NCT01644474)[48]表明低剂量的Alirocumab(75 mg /Q2W)与依折麦布相比在治疗24周后足以使大多数患者的LDL-c降低≥ 50% ,且两组之间的不良反应无差异。另一项Ⅲ期临床试验(NCT01516879)[49]证实单用evolocumab及加用低剂量或大剂量阿托伐他汀在52周时均明显降低接受指南推荐药物治疗的心血管疾病患者的LDL-c水平,与安慰剂相比下降57%,而最常见的不良反应是鼻咽炎、上呼吸道感染、流感及背痛。 365医学网 转载请注明
    到目前为止,PCSK9 抑制剂在临床试验中安全性良好[49,50],alirocumab和 evolocumab均未发生过严重或致命的不良反应,所有受试组的不良反应发生率类似,没有明显的剂量关系。有1例接受alirocumab 300mg治疗的患者9天后出现白细胞破碎性血管炎[44],考虑与药物相关,但具体机制尚不明确。而evolocumab的试验中最常见的不良反应为鼻咽炎,咳嗽,恶心和肌痛,但仅肌痛考虑与药物治疗有关[46,49]。目前Alirocumab、evolocumab及RN316/PF04950615 (Bacocizumab)多个Ⅲ期临床试验正在进行中,对心血管事件的影响需要等到2018年方能揭晓,届时将会提供更多有关此类药物对心血管事件的影响及长期单独或联合他汀治疗的安全性方面的证据。 365医学网 转载请注明
    PCSK9抑制剂联合他汀类药物或依折麦布能够更有效的降低胆固醇水平进而降低心血管风险。他汀类药物通过抑制胆固醇合成的限速酶羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶而降低肝细胞内胆固醇水平,从而激活SREBPs-2,因为LDLR和PCSK9在转录水平均受SREBPs-2的调节,LDLR和PCSK9的表达水平同时上调,而上调的PCSK9会通过增加LDLR降解而降低他汀的降脂效应。这在理论上解释了他汀类药物联用PCSK9抑制剂能够更好的降低LDL-c。365医学网 转载请注明
    总之,PCSK9作为枯草溶菌素蛋白激酶K亚家族的一个成员,在血脂代谢的调节中起关键作用,通过与LDL的结合及增加LDLR的降解,增加肠道细胞apoB的产生,调节胆固醇代谢及转运,干扰他汀类药物的降胆固醇作用。PCSK9功能获得性基因突变通过提高血浆LDL-c水平及其他机制导致动脉粥样硬化发生。PCSK9抑制剂(主要是mAb)的早期临床试验效果显著,安全性良好,特别是对他汀不耐受及家族性高胆固醇血症的患者提供了新的药物选择。但是仍需要进一步的研究探讨PCSK9抑制剂长期治疗降低LDL-c的安全性和潜在机制以及检验其对心血管终点事件及死亡率的影响。

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王文广
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