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牙周炎伴2型糖尿病患者非刺激性全唾液差异蛋白质组学研究
作者:王侗飞[1] 杨明[2] 郑燕华[1] 王继峰[3] 史琳涛[1] 杨福全[2] 汤楚华[1] 
单位:解放军306医院[1] 中国科学院生物物理研究所[2] 北京中医药大学第三附属医院(原北京冶金医院)[3]  
文章号:W116663  
2016/12/30 12:00:56    
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    慢性牙周炎是发生在牙齿支持组织的慢性感染性疾病,我国80%以上的成年人患有不同程度的牙周病,是导致成人失牙的主要原因[1]。2型糖尿病在我国20岁以上的人群中患病率为9.7%,其并发症累及多个器官,已成为致残率和死亡率很高的疾病[2]。牙周病和2型糖尿病都是慢性炎症性疾病,存在共同危险因素、且互为高危因素。唾液作为口腔免疫防御的重要组成部分,其成分的改变与许多临床病理过程有关。

    慢性牙周炎是发生在牙齿支持组织的慢性感染性疾病,我国80%以上的成年人患有不同程度的牙周病,是导致成人失牙的主要原因[1]。2型糖尿病在我国20岁以上的人群中患病率为9.7%,其并发症累及多个器官,已成为致残率和死亡率很高的疾病[2]。牙周病和2型糖尿病都是慢性炎症性疾病,存在共同危险因素、且互为高危因素。唾液作为口腔免疫防御的重要组成部分,其成分的改变与许多临床病理过程有关。唾液具有取样简单、无创、且能减少交叉感染等优点,其成分检测对于牙周炎伴2型糖尿病患者的诊治具有潜在的应用价值。本研究将利用串联质谱标签(tandem mass tags, TMT)标记结合高效液相色谱串联质谱(high performance liquid chromatography-MS/MS, HPLC-MS/MS)技术,通过对牙周炎伴2型糖尿病患者的非刺激性全唾液蛋白质组学研究,得到唾液蛋白质组信息,筛选出差异蛋白,为提高对牙周炎与2型糖尿病相互关系的认识奠定基础。365医学网 转载请注明
1  材料与方法365医学网 转载请注明
   
1.1  纳入和排除标准  ①纳入标准:年龄20~60岁,全口余留牙数>20颗。牙周健康:牙龈指数(GI)=0,出血指数(BI)=0,社区牙周指数(CPI)=0,X线片示全口牙列未见明显骨吸收;慢性牙周炎:全口余留牙数>20颗,至少有2个牙位点GI≥2、BI≥2、CPI≥3,X线片示全口牙列骨吸收普遍≥根长1/3。血糖正常:无糖尿病病史,糖化血红蛋白(HbA1c)≤6%,空腹血糖3.9~6.1 mmol/L,餐后2 h血糖≤7.8 mmol/L;2型糖尿病:半年以上2型糖尿病史,无严重糖尿病并发症,用药规律,近期血糖水平相对恒定,HbA1c在6%~10%。②排除标准:侵袭性牙周炎;口腔内有急性炎症;吸烟;6个月内有牙周系统治疗史;3个月内服用抗生素;患有除2型糖尿病以外的其他系统性疾病;近6个月经历外科手术或创伤;饮食和运动习惯有改变;妊娠期、哺乳期女性。365医学网 转载请注明
    1.2  一般资料  唾液样本均取自2015年6月-2015年12月于解放军306医院就诊患者。其中慢性牙周炎患者16例(A组)、2型糖尿病伴牙周健康患者4例(B组)、牙周炎伴2型糖尿病患者16例(C组)及非刺激性全唾液样本取自健康对照者16例(N组)。其中A组男8例,女8例,年龄(44.06±4.48)岁,CPI为(3.16±0.75);B组男2例,女2例,年龄(45.75±4.91)岁,HbA1c为(6.42±2.59)%;C组男8例,女8例,年龄(45.44±6.49)岁,CPI为(2.87±0.99),HbA1c为(8.05±2.10)%;N组男8例,女8例,年龄(27.11±4.25)岁。所有受试者均签署知情同意书。365医学网 转载请注明
    1.3  主要仪器设备  Q-Exactive质谱仪购自美国Thermo Finnigan公司,AKTA Purifier 100纯化仪和600V电泳仪购自美国通用医疗公司,低温高速离心机和真空离心浓缩仪购自德国Eppendorf公司,可见紫外分光光度计购自美国尤尼柯公司WFZ UV-2100。365医学网 转载请注明
    1.4  主要试剂  十二烷基硫酸钠(SDS),SDA-PAGE电泳缓冲液,尿素,胰酶,三羟甲基氨基甲烷(Tris),二硫苏糖醇(DTT),碘乙酰胺(IAA),乙腈(ACN)均购自Bio-rad公司;Ziptip C18脱盐吸头购自Sigma公司;6标TMT试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司。365医学网 转载请注明
    1.5  唾液采集与处理  所有受试者均采用吞取法采集唾液[3]。采集的唾液倒入已标记且4℃预冷的1.5 ml EP管中;4℃下以3000 g离心5 min,再以16 000 g离心30 min,留取上清液,200 µl/管分装、-80℃保存、备用。将N组样本按年龄、性别匹配随机分为两个亚组分别混合,记为N1组和N2组,作为两个生物学重复,其余各组各自混合为一个样本。采用BCA法对蛋白浓度进行定量,蛋白质还原烷基化酶样本处理,分别以126、127、128、129、130 TMT试剂对N1组、N2组、A组、B组、C组进行肽段标记。将抽干的肽段用含有0.1% TFA的水重溶至100 µl,用Ziptip脱盐。365医学网 转载请注明
    1.6  标记多肽的HPLC-MS/MS分析  每份样品采用纳升流速HPLC液相系统Easy nLC进行分离。采用Proteome Discoverer(version 1.4.0.288, Thermo Fischer Scientific)软件分析质谱原始数据RAW文件。MS2谱图使用SEQUEST搜索引擎搜索uniprot_Noctuidae_19458_20150317.fasta(收录序列19458条,下载日期2015-03-17)以及常见质谱污染蛋白混合库。检索参数为:母离子检索窗口20 ppm,二级谱图子离子检索窗口0.6 Da,内切酶Trypsin,两个酶切位点,甲硫氨酸氧化,半胱氨酸为固定修饰。检索的肽段和谱图匹配采用Percolator算法进行过滤,q值<1%(1%的FDR)。检索后的肽段利用严格的最大简约原则合并成蛋白。365医学网 转载请注明
    1.7  生物信息学分析  搜库后得到蛋白质差异结果,通过计算某一种蛋白质不同标记下的质谱结果比值(ratio值)来比较该蛋白质在不同组之间的差异表达。将各实验组ratio值超出正常组ratio值结果95%置信区间作为差异具有统计学意义;通过比对UnitProtKB数据库进一步筛选差异蛋白质。365医学网 转载请注明
2. 结果365医学网 转载请注明
    2.1  质谱鉴定结果  质谱数据经蛋白数据库搜索后,共获得蛋白质总数630个,筛选出差异蛋白75个。在A组有上调蛋白8个、下调蛋白1个;在B组有上调蛋白31个、下调蛋白33个;在C组有上调蛋白28个,下调蛋白22个。其中,A组与B组重叠的上调蛋白质有1个,B组与C组重叠的上调蛋白质有21个,绘制重叠区域维恩图。见图1。A组与C组重叠的下调蛋白质有1个,B组与C组重叠的下调蛋白质有19个,绘制重叠区域维恩图。见图2365医学网 转载请注明
    2.2  差异蛋白质生物信息学分析结果  通过UnitProtKB数据库对筛选出的75个差异蛋白质的详细信息进行查阅,共筛选出13个与牙周炎伴2型糖尿病可能相关的蛋白质。其中上调6个,分别为膜联蛋白A1、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂、唾液凝集素、溶菌酶C、丝氨酸蛋白酶抑制剂A1、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3;下调7个,分别为结合珠蛋白、前纤维蛋白1、钙结合蛋白S100P、葡萄糖-6-磷酸异构酶、乳酸脱氢酶、醛羧转移酶、碳酸酐酶1。见表1。

3  讨论365医学网 转载请注明
    牙周炎和2型糖尿病都是严重危害人类健康的常见病,研究表明牙周炎既是糖尿病的危险因素,也是糖尿病的并发症[4]。人类唾液中含有大量的蛋白质,这些蛋白质对维持口腔生态环境稳定起到重要的作用。随着蛋白组学技术的发展,唾液蛋白组学研究在近年来也备受关注。Rao等[5]对2型糖尿病与健康者的全唾液进行2D-LC-MS/MS分析,在2型糖尿病受试者全唾液中共发现487个蛋白,其中65个蛋白质表现出相对于健康人2倍的差异;Chan等[6]发现2型糖尿病受试者中牙周炎患者与牙周健康者的唾液中有7个蛋白有显著差异;Salazar等[7]对慢性牙周炎受试者与健康者的全唾液进行分析,共发现344个蛋白,其中20个蛋白表现出1.5倍的丰度差异。365医学网 转载请注明
    本研究采用TMT标记结合HPLC-MS/MS技术对非刺激性全唾液内的蛋白质组进行分析,该技术可以大规模、高通量、系统化研究唾液中蛋白质组成,提高蛋白质检出率,且具备速度快、灵敏度高、定量准确等特点[8]。本研究总计获得630个蛋白,包含了75个差异蛋白。2型糖尿病受试者中,牙周炎与牙周健康患者之间共有40个差异蛋白,重合度较高。说明在患有2型糖尿病的患者中,相较于牙周炎症,机体的高糖水平可能在口腔唾液蛋白质组的改变中起到主导作用。本研究中2型糖尿病牙周健康组样本量较少,这与我国成人牙周病高发有关,也与病例收集时间不足有关,可能会对检测结果产生一定影响。365医学网 转载请注明
    在本研究发现的6个上调蛋白质中,丝氨酸蛋白酶抑制剂A1和A3参与机体免疫反应,对凝血、细胞迁移分化、细胞内蛋白水解等生化反应和生理功能有重要的影响[9]。A组唾液中丝氨酸蛋白酶抑制剂A1和A3显著上调,目前尚未发现该蛋白质与慢性牙周炎的相关性报道。在2型糖尿病受试者唾液中,膜联蛋白A1,分泌性白细胞蛋白酶抑制剂,唾液凝集素,溶菌酶C均上调。其中,分泌性白细胞蛋白酶抑制剂是一种非糖基化蛋白,具有抗菌、抗病毒、和诱导细胞增殖分化等多方面生物学活性,还可通过多种途径来调控创伤微环境,从而影响创伤愈合进程[10-12]。唾液凝集素是一种能与细菌发生作用的糖蛋白,可作用于口腔中的多种细菌,处于液相中的唾液凝集素主要介导细菌凝集,吸附于固相上的唾液凝集素则介导细菌的黏附[13]。菌斑生物膜是牙周炎的始动因素,唾液凝集素的上调,有助于菌斑的黏附堆积,这可能是导致糖尿病患者牙周炎高发的原因之一。溶菌酶是一种广泛存在于唾液中的水解酶,作为牙龈弹性纤维的保护屏障,其活性与牙龈炎的发病率呈正比,本研究中糖尿病受试者溶菌酶C上调,提示糖尿病患牙龈炎的风险高于健康人[14]。有学者发现在1型糖尿病患儿唾液中溶菌酶含量与正常儿童相比升高,与本研究结果类似[15]。而Zalewska等[16]的研究显示出相反的结果。365医学网 转载请注明
    在本研究发现的7个下调蛋白质中,葡萄糖-6-磷酸异构酶、乳酸脱氢酶作为糖代谢蛋白,在B和C组中均下调,可能与糖尿病状态下糖代谢异常有关。而醛羧转移酶、碳酸酐酶1、前纤维蛋白1、结合珠蛋白、钙结合蛋白S100P仅在C组唾液中显示差异。醛羧转移酶和碳酸酐酶1参与糖代谢,其下调可能与牙周炎症加重及糖代谢异常有关。结合珠蛋白具有抗氧化活性、抗炎、抗菌、促进血管生成等作用[17]。其下调会导致组织的氧化损伤加重和牙周组织破坏,这可能是牙周炎伴2型糖尿病患者较慢性牙周炎患者牙周破坏更为严重的原因。钙结合蛋白S100P参与了多种细胞内功能的调节,可以通过非经典途径与晚期糖基化终末产物受体结合发挥生物细胞外信号传导作用,与多种肿瘤的发生发展有关[18]。本研究中钙结合蛋白S100P下调,其在牙周炎或2型糖尿病发病过程中的作用还有待进一步的研究。365医学网 转载请注明
    本研究样本量较小,尚存在一定的局限性,不能完全排除该因素对检测结果的影响。本实验筛选出牙周炎伴2型糖尿病患者唾液中的13个差异蛋白质,可能是参与牙周炎与2型糖尿病相互作用的相关蛋白,也有可能作为牙周炎伴2型糖尿病唾液生物标记物的候选蛋白,尚需在后续研究中进一步验证。365医学网 转载请注明
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