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嵌合抗原受体T细胞在急性淋巴细胞白血病治疗中的研究进展
作者:翁雯雯[1] 汤永民[1] 
单位:浙江大学医学院附属儿童医院[1]  
文章号:W138725  
2019/9/18 16:28:58    
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摘要  嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法是目前治疗复发难治性急性淋巴细胞白血病的有效方法。近年来,该领域研究发展迅速,尤其在CAR基因结构的改进、CAR-T细胞治疗过程中不良反应的发生及其对策、新技术的应用等方面有了明显的进展。本综述主要阐述CAR-T的结构和新型设计、不良反应及其对策、基因编辑新技术的应用以及提高CAR-T疗法有效性和安全性等方面的进展。   在过去的10年中,患者自身免疫反应的激活已成为癌症治疗的第4种治疗选择。

摘要

  嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法是目前治疗复发难治性急性淋巴细胞白血病的有效方法。近年来,该领域研究发展迅速,尤其在CAR基因结构的改进、CAR-T细胞治疗过程中不良反应的发生及其对策、新技术的应用等方面有了明显的进展。本综述主要阐述CAR-T的结构和新型设计、不良反应及其对策、基因编辑新技术的应用以及提高CAR-T疗法有效性和安全性等方面的进展。


  在过去的10年中,患者自身免疫反应的激活已成为癌症治疗的第4种治疗选择。特别是应用嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)重定向到肿瘤患者T细胞的过继转移已经实现血液肿瘤性疾病的显著缓解,其中抗CD19 CAR-T细胞产物CTL019(tisagenlecleucel,Kymriah,Novartis)用于儿童复发、难治性B细胞急性淋巴细胞白血病,是第1个被美国食品和药物监督管理局批准的基因修饰细胞疗法[1]。然而,特异性CAR-T细胞疗法也存在明显的不良反应,如细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome, CRS)和神经毒性等。为了增加CAR-T细胞的疗效,减少不良反应,近年来该领域有了明显的进展,现就该领域的最新研究进展进行阐述。


一、CAR基因结构的改进


  CAR是人工构建并能识别抗原和激活T细胞的功能基因片段,当将其导入细胞,可使其在T细胞等免疫活性细胞膜上稳定表达,并使这些免疫活性细胞具有重定向特异性识别的功能[2]。CAR构建体通常由以下组分组成:抗原识别结构域[免疫球蛋白的鼠或人源化单链可变片段(single chain variable fragment,scFv)],铰链或间隔区,跨膜结构,一个或多个共刺激结构域(通常为CD28或4-1BB)和一个主要的信号域,通常是CD3ζ链。第一代CAR仅具有CD3ζ信号传导结构域,其仅为T细胞激活提供信号[3]。使用第一代CAR治疗癌症的早期临床试验表明杀伤肿瘤细胞的反应非常有限,CAR修饰的细胞仅在数周至数月内就持续低水平,这表明第一代CAR-T细胞缺乏足够的激活信号来支持抗肿瘤效应所需的长期T细胞的扩增[4]。第二代CAR-T细胞通过将来自共刺激结构域(例如CD28、CD137即4-1BB)的信号传导结构域添加至CAR的细胞内结构域以产生额外的T细胞刺激和激活的信号,使其在体内的扩增和持续能力提高,这一现象已在临床试验中得到证实[5]。第三代CAR在细胞内信号传导结构域中含有多个共刺激结构域,然而,第三代CAR的临床试验结果不比第二代更有优势,反而增加了不良反应[6]。第四代CAR由于增加了细胞因子的基因,在识别特异性抗原后,CAR-T细胞被激活并分泌细胞因子,有增强杀伤肿瘤细胞的能力。


  目前正在研究的不同设计的CAR包括下列5种:(1)靶向基因座CAR(TCRα constant CAR,TRAC-CAR),将CAR靶向特定基因,通过哺乳动物质粒转染、mRNA转染、病毒转导或转座酶将当前CAR载体递送到T细胞中[7]。为避免克隆扩增、不可预测的转基因表达、致癌转化和基因沉默等严重后果,Sadelain[8]使用成簇规则排列的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)-(CRISPR-associated 9,Cas9)方法将CD19 CAR整合到特定的TCRα恒定(TRAC)基因位点。与随机转导的CAR-T细胞相比,小鼠ALL模型中TRAC-CAR的T细胞杀伤能力更强,持续时间更长,且具有更强的记忆能力。靶向基因座的CAR证明了CAR在T细胞表面上的最佳表达。TRAC-CAR动态表达似乎受到TCR增强子或启动子的调节,以响应抗原的反复刺激,模仿TCR调节的自然过程。该研究是CRISPR-Cas9成功进行T细胞基因组编辑的一个例子。(2)反向免疫抑制性CAR(reverse immuno suppressive CAR),肿瘤可以利用免疫抑制性微环境来逃避宿主免疫细胞的免疫杀伤作用,例如产生抑制性细胞因子,包括白细胞介素(interleukin,IL)4,IL-10,转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),促进肿瘤生长并保护肿瘤免受免疫打击。而反向免疫抑制性CAR可以使肿瘤来源的IL-4的抑制作用逆转为T细胞增殖并增强自身的抗肿瘤活性。优点是限制CAR-T细胞的脱靶效应,对不富含抑制因子(如IL-4)的正常组织中以低水平表达的肿瘤抗原。这些结果表明共刺激分子与CAR信号传导结构域中的抗抑制信号的组合可以进一步改善CAR-T细胞疗法的临床益处[9,10]。(3)双特异性CAR(bispecific CAR),双特异性CAR是一种融合了两种单链抗体(scFv)的识别双靶点的特异性CAR,它可以识别双重抗原位点。例如CD19-CD20-CAR-T细胞能够以相同的体内效率控制野生型B细胞淋巴瘤和CD19突变体[11],CD19-HER2-CAR,可以同时靶向CD19和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER 2)。在B细胞淋巴瘤的小鼠模型中测定CD19-HER2-CAR的功效,其诱导针对每种抗原的T细胞反应性不同,并且当呈递两种抗原时效应功能的协同增强由于肿瘤会出现抗原的丧失,双特异性CAR有助于克服过继性细胞疗法效率低的缺点。(4)抑制性CAR(inhibitory CAR,iCAR):iCAR通常与常规CAR一起递送至T细胞中,iCAR识别来自常规CAR的不同抗原,并且其scFv与程序性死亡受体1或细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4细胞质结构域融合。当靶向T细胞表达CAR特异性抗原时,CAR被激活并发挥细胞毒活性;当靶向T细胞表达两种抗原时,iCAR被激活并传递负信号,从而抑制CAR的功能。iCAR用于通过靶向在健康组织上表达但在肿瘤中减少的蛋白质来减少对正常组织的杀伤。(5)亲和调节的CAR(fine-tuned CAR):亲和调节的CAR基于抗原-抗体的亲和力,可以筛选区分出正常组织与肿瘤中不同表达水平抗原的抗体。低亲和力scFv的CAR选择性地靶向高表达表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的细胞,对低表达EGFR的细胞没有影响。通过这种策略,亲和力调节的scFv可以选择在正常组织中存在但在肿瘤中高表达的抗原[12]。


二、CAR-T细胞疗法的不良反应及其对策


  虽然CAR-T疗法在治疗复发难治性白血病的疗效显著,但它也存在明显的不良反应。CAR-T细胞疗法的毒性可分为以下4类。(1)在靶,肿瘤内毒性:如CRS和肿瘤溶解综合征;(2)在靶,肿瘤外毒性:特别是抗CD19-CAR-T细胞治疗后的B细胞再生不良和在实体瘤的CAR-T细胞治疗中对健康组织的肿瘤相关抗原的靶向伤害;(3)脱靶,在CAR-T细胞疗法的实验模型中观察到的肿瘤外毒性;(4)遗传毒性,这是一种假设的风险,可能与逆转录病毒和慢病毒在CAR-T细胞构建中的应用有关[13]。慢病毒或g-逆转录病毒这两种载体都会导致随机基因组整合,从而导致基因表达变异,它们也可能与致癌转化有关,尽管目前CAR-T细胞疗法从未报道过致癌的案例,但出现了CAR的脱轨。Fraietta等[14]报道了靶向CD19抗原的CAR-T细胞治疗慢性淋巴细胞白血病患者时出现CAR转基因插入破坏了甲基胞嘧啶双加氧酶TET2基因,而使CAR-T细胞的扩增能力更强,更持久的案例。Ruella等[15]报道1例白血病患者输注靶向CD19的CAR-T细胞后9个月出现复发,并且肿瘤细胞异常表达CD19 CAR的案例。靶向CD19的CAR-T在识别表达CD19的细胞,包括正常B细胞或CD19+的肿瘤细胞后,CAR-T细胞增殖,对靶细胞发挥细胞毒作用,并释放可能引发全身炎症反应的细胞因子[16]。这被认为是启动CRS,CRS是抗CD19 CAR-T细胞治疗后最常见的并发症,发生率为78%~100%,严重CRS的发生率高于15%,具体表现随CAR-T细胞的类型不同而不同,但通常在CAR-T细胞输注后几天内发生,其临床特征包括各种全身症状,如发热、低血压、毛细血管渗漏、凝血功能障碍相关疾病,偶见多器官衰竭等,CRS的严重程度受输注细胞数量、肿瘤负荷和体内CAR-T细胞增殖程度的影响,严重的CRS可演变为暴发性的噬血性淋巴组织细胞增生症(hemolytic lymphocytic hyperplasia,HLH)[17]。而CAR-T相关脑病综合征(CAR-T cell related encephalopathy syndrome,CRES)表现为头痛、谵妄、意识不清、失语,偶尔会抽搐和脑水肿,CRES通常与CRS有关,但很少同时出现,通常在CRS后几天到几周延迟发生,并且在大多数情况下是可逆的[18]。Gauthier和Turtle[18]发现CRES的患者血脑屏障的通透性增加,并发现血脑屏障未能保护脑脊液免受高浓度的全身细胞因子的影响。


三、应用CRISPR技术优化CAR基因


  CRISPR-Cas9源自Ⅱ型CRISPR-Cas9系统,可为细菌提供对病毒、质粒和其他外源核酸的适应性免疫,被重新用作RNA引导DNA的编辑基因组,调控转录,调整表观遗传和基因组成像的靶向平台[19]。Ⅱ型CRISPR系统掺入来自CRISPR重复序列之间的入侵DNA的序列,来自CRISPR重复序列的转录物被加工成CRISPR RNA(crRNA),每个都包含从入侵DNA转录的可变序列,其被称为"原型间隔区"序列,并且是CRISPR重复序列的一部分。每个crRNA与第二RNA杂交,被称为反式激活CRISPR RNA(tracrRNA),并且这两种RNA与Cas9 DNA核酸内切酶形成复合物,如果它们与称为原型间隔区相邻基序(protospacer adjacent motif,PAM)的短序列相邻,则crRNA的原型间隔区编码部分将Cas9引导至互补的靶DNA序列并切割DNA[20]。使用CRISPR-Cas9系统能产生抵抗耗竭和抑制的通用CAR-T细胞和T细胞。目前的CAR-T细胞疗法是取异体通用供体T细胞,但是异体T细胞上的内源性TCR可能识别受体的异体抗原,导致移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD);此外,异体T细胞表面HLA的表达会引起宿主免疫系统的快速排斥反应。在此背景下,CRISPR-Cas9被用来敲除T细胞内源性T细胞受体基因,可以防止不必要的移植物抗宿主反应[21,22]。基因组编辑还可以通过消除或减少供体T细胞上主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)的表达来防止或延缓受体免疫系统对CAR-T细胞的排斥反应。CRISPR-Cas9系统同时破坏多个基因组位点,使CAR-T细胞缺乏内源性T细胞受体(t cell receptor,TCR)和人类白细胞抗原Ⅰ类(human leukocyte antigen-Ⅰ,HLA-Ⅰ)的表达,研制出通用CAR-T细胞[23]。基因组编辑的最新进展可以特异性干预人类细胞中的有效序列[24,25],包括向CCR5和AAVS1基因位点的靶向基因递送,可以将CD19特异性CAR导向TRAC基因位点不仅导致人外周血T细胞中均一的CAR表达,而且还增强T细胞效力,编辑细胞的表现远远超过常规ALL小鼠模型中产生的CAR-T细胞量。这进一步证明,将CAR靶向TRAC基因位点可避免直接CAR的信号传导,并在单次或反复接触抗原后建立CAR的有效内化和重新表达,延迟效应T细胞的分化和疲劳[26]。


四、展望


  虽然抗CD19 CAR-T细胞临床试验已经显示出治疗急性淋巴细胞白血病的显著疗效,但大多数患者在治疗后的第1年内仍然复发。关于如何最好地利用基因工程和CAR-T以产生最佳效果仍然存在许多问题,优化CAR-T细胞疗法仍有很长的路要走。另外,创新的基因编辑平台,如CRISPR-Cas9等,也将有助于CAR基因更好和更稳定地表达,设计完全人源化CAR基因可显著降低CAR的免疫原性以改善疗效的持久性。临床试验结果表明16%~49%和13%~50%的病例发生严重的CRS和CRES,因此,减小不良反应的发生刻不容缓[27]。为此,有几种"关闭"CAR-T细胞增殖的方法已被研发出来,一种方法是用可诱导的Caspase-9自杀基因转导CAR-T细胞,当出现难以控制的CRS或CRES时给予二聚体分子将诱发CAR-T细胞迅速凋亡;另一种方法是转导编码HSV胸苷激酶的基因,使细胞对更昔洛韦敏感而致死[28]。这些方法虽然有效,但将导致CAR-T的永久性丧失,现在抗CD19 CAR-T细胞的研究面临着将疗效与毒性分开的挑战。基于风险因素的分次给药或个性化的剂量减少等预防措施可能会降低严重不良事件的发生率[27]。


  综上,CAR-T细胞疗法是一种极具潜力的免疫疗法,在急性淋巴细胞白血病已经取得良好的临床疗效。虽然其疗效和安全性有待提高,目前临床前实验也还在积极地进行,通过CRISPR技术进行基因组编辑以优化CAR基因结构来提高CAR-T细胞疗效的持久性和减少不良反应,希望通过设计多种CAR-T细胞来克服毒性和免疫原性对治疗造成的负面影响。可以预见,下一代多特异性整合的CAR-T细胞可能在不久的将来表现出更有针对性和更令人满意的临床疗效。


参考文献(略)

文章来源于公众号:中华儿科杂志

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作者简介
翁雯雯
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