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影响房颤患者华法林抗凝作用的多因素分析
作者:韩明华[1] 
单位:云南省第二人民医院(云南大学第一临床医学院、云南省红十字会医院)[1]  
文章号:W059961  
2011/6/23 9:57:36    
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华法林作为一种香豆素类的维生素K拮抗剂,被广泛应用于血栓性疾病的预防和治疗。房颤是临床最常见的心律失常,缺血性中风等血栓栓塞事件是房颤常见的并发症。研究证明预防房颤相关的血栓栓塞性事件尤其是缺血性中风高危患者目前最有效的药物是华法林,但因其疗效影响因素多,个体差异大,安全窗口窄,在临床应用中如果不连续规律监测凝血酶原时间(INR值),根据INR值及时调整华法林剂量,就容易导致剂量不足没有达到抗凝效果要不就剂量过大抗凝过头发生出血副作用,防碍了该药的安全有效应用,而现在又没有找到与之疗效相似或更好而副作用更轻更安全的药物来代替华法林。如何合理有效安全地使用华法林是临床需要解决的切实问题。

关键词:华法林,CYP2C9VKORC1,影响因素

背景:华法林作为一种香豆素类的维生素K拮抗剂,被广泛应用于血栓性疾病的预防和治疗。房颤是临床最常见的心律失常,缺血性中风等血栓栓塞事件是房颤常见的并发症。研究证明预防房颤相关的血栓栓塞性事件尤其是缺血性中风高危患者目前最有效的药物是华法林,但因其疗效影响因素多,个体差异大,安全窗口窄,在临床应用中如果不连续规律监测凝血酶原时间(INR值),根据INR值及时调整华法林剂量,就容易导致剂量不足没有达到抗凝效果要不就剂量过大抗凝过头发生出血副作用,防碍了该药的安全有效应用,而现在又没有找到与之疗效相似或更好而副作用更轻更安全的药物来代替华法林。如何合理有效安全地使用华法林是临床需要解决的切实问题。

目的:本研究通过分析国内外研究现状,根据可能会影响华法林抗凝作用的相关因素,如基因分型,性别,年龄,合并用药及疾病状态等,收集房颤患者服用华法林的相关资料。进行汇总分析,统计。得出相关的影响因素及回归方程。寻找华法林安全有效简单容易的个体化合理使用方法。

方法:选取86例有服用华法林指征的房颤患者为研究对象,男41例,女45例,平均年龄62岁(40-78)。每位患者开始服华法林3mg/日之前测INR值一次,随后于第3天、第一周、第二周连续测3INR值。如果第三次的INR<2.0的患者分为低敏组,INR值在23范围的患者列为正常组,INR值在3以上的患者列为高敏组。之后,根据INR值调整华法林剂量并且每周监测INR值一次,观测INR值稳定在2-3时每位患者的华法林维持量。同时收集每位患者合并疾病状况,用药情况及性别、年龄、体重等相关资料。并抽静脉血4ml,提取DNA,并进行直接DNA测序。确定每位患者的细胞色素P450家族2亚家族C多肽9CYP2C9)和维生素K环氧化物还原酶复合体1VKORC1)分型。所有试验数据采用spss13.5软件包处理分析。将收集到的各项指标先进行单因素分析,再将单因素分析中具有显著性差异的因子进行多元线性回归分析,得出危险因素,建立回归方程。计数资料以构成比表示,计量资料以均值±标准差(`x±s)表示,连续性资料比较采用单因素方差分析或独立样本t检验,非连续性资料比较采用Χ2检验或Fisher 精确概率法,p<0.05为差异有统计学意义。

结果:单因素分析显示3组患者在性别构成,基础疾病(高血压、糖尿病、心功能不全、脑卒中),控制心率方面无统计学差异。在年龄,体重及CYP2C9VKORC1基因分型上有显著差异。高敏组的年龄构成高于低敏组及正常组。再进一步以CYP2C9VKORC1基因型进行分组,发现年龄在各基因分组之间无统计学差异。华法林维持剂量与CYP2C9VKORC1基因型之间方差分析显示:华法林维持剂量在CYP2C9AA型中剂量最高,AC型中剂量居中,CC型剂量最低;在VKORC1-1639A基因型中也得出类似结果。华法林维持剂量在CYP2C9-1075CAA型为8.33±1.81AC型为5.33±2.27CC型为3.32±1.75;在VKORC1-1639AGG型为8.39±1.69GA型为5.46±1.37AA型为4.21±1.31。将这些观察因素进行多元回归线性方程显示:年龄、体重、CYP2C91061VKORC1-1639为影响华法林抗凝作用的独立影响因素。

结论:1、单因素分析显示在高敏组、正常组、低敏组患者中年龄、体重、基因差异上差异明显。2、多因素分析显示:年龄、体重、CYP2C91061VKORC1-1639基因差异为影响华法林抗凝作用的独立影响因素。3、建立的多元线性回归方程预测华法林所需剂量的准确值为52%4、本研究探讨了影响华法林抗凝作用的相关因素,并建立了多元回归方程,为华法林个体化合理安全使用提供了一定的参考意义。

Abstract

BackgroundWarfarin as a coumarin kind of vitamin K antagonists, are widely used in thrombotic diseases prevention and treatment of cardiovascular physician in patients with atrial fibrillation is mainly used for the anticoagulation. Butbecause of its safety window narrower, individual differences.Use of excessive easy cause skin mucous membrane, gastrointestinal and intracerebral hemorrhage. Underdosed nor anticoagulant effect. Lead in clinical use a tremendous limits on. How to reasonably and effectively use warfarin is the clinical needs to solve practical problems.

Objective: this study through the analysis of the status quo, according to research at home and abroad of anticoagulant warfarin may influence the related factors, such as role genotyped, gender, age, merger drug and disease states, such as collection of af patients taking warfarin related material. Summarize and analyze, statistics. That the relevant factors and regression equation. For warfarin use of personalized and rationalization, provides the basis.

Methods: select 2009 until 2011 in heart medicine hospitalization af and 86 patients taking warfarin as the research object. Every patients take warfarin INR was once before, measured after take warfarin INR was measured again later, once a week, according to INR was measured INR was adjusted warfarin dose. Acquisition of their disease status, drug and sex, age, weight and other related material. And 4ml, smoke venous blood, and extracted DNA direct DNA sequencing. Determine its CYP2C9 and VKORC1 parting. All test data processing analysis by SPSS software. The indicators of collected firstly, and then the single factor analysis of the single factor analysis has significant difference in the factor, more factors logistic regression analysis (Forward method), draw risk factors, a regression equation. Count data to constitute,  mean + sd (x + s) says, continuity material`measurement data than said in  compares the single factor analysis of variance or independent sample t-test, discontinuity material compares the Fisher accurate inspection or Χ 2, p < 0.05 probability method for difference have statistical significance.

Results: the single factor analysis showed three groups of patients in the gender structure, basic diseases (high blood pressure, diabetes, cardiac insufficiency, stroke), control in heart rate was not statistically significant. In age, weight and CYP2C9 and VKORC1 genotyped had a remarkable difference. Gao min group of age groups and constitutes a higher than normal group low sensitivity, and body mass index is lower than the normal group and low sensitive group.

Further to CYP2C9 and VKORC1 genotype group, found that age and weight index between in every gene group was not statistically significant. For warfarin maintenance dose VKORC1 genotypes with CYP2C9 and variance analysis showed that between CYP2C91061AA warfarin maintenance dose of the highest dose of AC type center, CC type dose doses in VKORC1 - the lowest, genotype kind of also draw 1639 similar results.Multiple regression linear equations show age, weight, CYP2C91061, VKORC1-1639 for changing warfarin anticoagulant effect factors affecting the independent.

conclusion:1 single factor analysis showed that in gao min group, the normal group and low sensitive groups of patients, age, sex, weight, gene differences differences are significant. 2 multi-factor analysis indicated: age, sex, weight, CYP2C91061, VKORC1-1639 genetic differences of anticoagulant warfarin role for the influence of the independent factors. 3 build multiple linear regression equation prediction warfarin dosage required for 52% of accurate value. 4 this study explores the influence of anticoagulant warfarin role related factors, and established a multiple regression equation, for reasonable individual use warfarin provides some reference significance.

Keywords: Warfarin, CYP2C9, VKORC1, influenctial factors

 

而随着人口老龄化的发展以及生活节奏的加快。心脑血管疾病的发病率和致死率呈明显的上升趋势。而房颤是临床最常见的心律失常。发病率随年龄的增加而增加,据调查:50 59岁人群的发病律为0.5%,而80 89岁人群的发病率为8.8%,正常人群发病率为0.152.3%。预计2050年,全球房颤患者总数将比现在至少增加2.5倍。脑卒中是房颤患者的主要并发症之一。据统计91%房颤栓塞的并发症为脑栓塞,至少15% 20%缺血性脑卒中由房颤所诱发。

华法林(warfarin)是上世纪40年代由美国Wisconsin大学研制的香豆素类口服抗凝药物。因为其确切的疗效广泛应用于多种疾病的抗凝治疗。如瓣膜置换,非瓣膜病性房颤,电复律,冠心病,肺栓塞,和深静脉血栓形成等。至问世以来,经过多项大型随机对照临床试验已经证明能华法林抗凝治疗能降低房颤患者脑卒中的危险。因此应用华法林是预防房颤患者发生脑卒中的标准治疗。据统计使用华法林进行适当的抗凝治疗能使房颤患者卒中率减少约70%,死亡率减少约26%

根据2010ESC房颤卒中危险分层(CHA2DS2VASc)所罗列的危险因素:慢性心衰/左室功能障碍(1分),高血压(1分),年龄大于75岁(2分),糖尿病(1分),卒中/短暂性脑缺血发作(TIA/血栓栓塞病史(2分),血管疾病(1分),年龄6574岁(1分),性别(女性,1分)。最高积分为9分,积分在2分以上患者均应接受华法林抗凝治疗,使国际标准化比值(INR)维持在23范围。但由于华法林受基因、疾病合并用药、年龄、性别等个体因素的影响,其有效治疗范围较窄且不同个体之间维持剂量存在较大差异。在使用华法林治疗初期,由于无法掌握到准确剂量,剂量不足易导致血栓发生,剂量过高极易导致严重的出血并发症,这使许多医务工作者,特别是基层医生对华法林的使用产生顾虑和畏难情绪。服用华法林时频繁抽血检测INR值,造成患者抵触情绪,依从性不高。这导致华法林在临床应用中受到极大限制。据中国房颤流行病学调查:超过97%的房颤患者没有服用过华法林,怎样有效规范得使用华法林,是房颤抗凝治疗的重要问题[1]

在华法林的应用早期,临床医生用药时患者年龄,体质量,性别等因素对华法林敏感度作出预判,判断准确率低,从而导致医生用药信心不足,出现过过度检测凝血功能,抗凝治疗强度难以达到平稳有效。患者对服用华法林依从性低等问题。随着分子生物学及药物遗传学的发展,在上世纪末,开始有学者研究不同人种间华法林敏感性的差异。发现当INR值控制在23的范围内,华人华法林维持剂量比白种人要低约50%.英国学者Blann A等通过对照研究后也指出民族因素是影响华法林剂量的主要影响因素[2]。近年来国内外研究表明维生素环氧化物还原酶复合物亚基1VKROC1)和细胞色素P450同工酶家族2亚家族C多肽9CYP2C9)多态性变异对华法林在人体内的药理作用有重要影响。随后又发现载脂蛋白E(ApoE)Y-谷氨酸羧化酶(GGCX),多药耐药基因(MDRI),内质网伴侣蛋白(CALU)等基因多态性也可能对华法林维持剂量产生影响[3-10]。并主要根据VKROC1CYP2C9基因多态性及年龄,身高,体重建立了不同人群华法林个体化剂量模型。为更加合理有效使用华法林迈出了重要一步。

本课题收集了86例服用华法林患者的疾病、合并用药、体质量、性别、年龄等临床相关资料。并抽取静脉血检查患者VKROC1CYP2C9相关基因多态性。采用住院观察,门诊随访等方式观察患者INR值,并根据INR调整华法林剂量。使之维持在23范围。探讨各相关因素对华法林剂量的影响,建立本地人群的华法林剂量-与华法林INR值相关性模型。为华法林的个体化用药及更为有效的抗凝治疗提供有价值的临床参考依据。

研究设计与方法

一、研究对象

2009-2011年在昆明医学院第一附属医院心内科住院服用华法林的房颤患者共86例作为研究对象,入选患者年龄范围为4078岁。

入选标准

根据CHADS2评分标准或进行房颤射频消融术需口服华法林抗凝治疗,无凝血功能障碍、肝功能异常、血小板减少、严重且未控制的高血压(大于180/110mmHg)、消化道大出血病史和颅内出血病史等华法林治疗禁忌症。知晓该治疗的必要性及相关风险,同意并能配合临床随访,服用华法林至少一个月。全部86例患者均定居于云南,汉族83例、彝族2例、白族1例,饮食结构及生活环境相似。其中阵发性房颤患者57例,持续性房颤患者29例。男性41例,女性45例,年龄4078岁,平均62岁。合并原发性高血压35例,慢性心功能不全18例,2型糖尿病11例,既往陈旧性脑梗死病史患者9例。

研究对象随访采用住院观察、门诊复查、电话随访,随访期间详细记录患者临床资料、华法林起始剂量、维持剂量及对应的INR值,随访过程中INR值出现较大波动时可能的诱因及出血并发症、中枢性脑栓塞(脑卒中)、周围性栓塞、死亡等相关情况。

二、材料准备:

1.主要试剂

Wizard Genomic DNA提取试剂盒购自北京构尔德生物发展有限公司

PCR反应液(10×buffer with Mg 5u/ul Taq酶)购自北京天根生物有限公司

4×dNTPs 2.5mm 购自北京构尔德生物发展有限公司

引物:由上海生工生物工程服务有限公司合成,用灭菌水配成10mmol/l溶液,-20度保存。

标准琼脂糖:购自大连宝生物工程有限公司

2.主要仪器

Heraeus Hfu586std-v12 超低温冰箱  上海江莱生物科技有限公司

Pac-300电泳仪                     长沙欧标生物科技有限公司

TGL-168高速台式离心机             江苏省金坛市医疗仪器厂

Heraeus Megfuge10.OR高速离心机    上海富众生物科学有限公司

GeneAmp PCR System 9600            北京众磊生物科技有限公司

Gis 100凝胶成像分析系统               南京驰顺科技发展有限公司

3.INR值测定

空腹抽取患者肘静脉血3mL,用浓度为109mmol/L的枸橼酸钠0.2mL混匀抗凝,2500rpm离心1012min,分离血浆后采用德国BC-4半自动凝血仪。测定凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT),采用1982INR值标准模型计算公式计算INR值:INR=PT/平均正常PTISI(ISI为国际敏感指数,代表凝血酶反应性)

4.DNA提取

1)用2只紫头枸橼酸钠EP管各抽取患者肘静脉血2ml,将印管放入TGL-168高速离心机中,以1000/min离心10分钟后,取出EP管。

2)用1000ul枪头将血清抽取干净,将EP管中滴入cell lysis soution 900ul,混匀后,将EP管放入Heraeus Megfuge10.OR低温高速离心机以13000/min离心20秒后。取出EP管。

3)向EP管中滴入protein precipitation solution 100ul,快速混匀,震荡10S后,以13000/转再次离心3分钟后取出,取上清液体倒入另一支EP管。

4)将异丙醇lso 300ul,混匀后,再次离心,1min后倾倒去上清液体。

5)加入75%乙醇etharol,轻轻混匀,上述条件离心1min后倾倒去上清液体后,可见EP管底部有一白色圆粒状DNA

6) 晾置后加入DNA rehydration solution 400ml,置于-24度冰箱中保存备用。

5.DNA定量

采用琼脂糖凝胶测定样品DNA浓度。电泳条件:4v/cm,1%琼脂糖凝胶电泳30分钟,凝胶成像,并进行DNA浓度粗定量。然后调节DNA使用浓度至2030ug/ul备用。

6.引物设计

1)根据DNAstar7.0设计CYP2C9*3A1061CC=52.9)基因引物序列

C430T-上游5-CAG AGA CTT ACA GAG CTCCT

C430T-下游3-GAG CTA ACA ACC AGG ACTTC

2)根据DNAstar7.0设计VKROC1G-1639A(T=54.4) 基因引物序列

G-163A-上游5-CAA GTT CCA GGG ATT CATGC

G-163A-下游3-CCA AGA CGC TAG ACC CACCT

3PCR反应及测序

PCR程序

96孔板在GeneAmp PCR System 9600 上进行PCR扩增,具体 PCR反应程序如下:

94度预变性3min94度变性15sec65度退火30sec72度延伸30sec(5cycles)94度变性15sec60度退火30se72度延伸30sec(21cycles)94度变性15sec55度退火1min72度延伸3min(21cycles)72度延伸7min

4PCR产物琼脂糖电泳的检测

对血样抽取的DNA在特定位点进行扩增后,先进行琼脂糖电泳的检测,看是否有需要的目的条带,同时初步判断PCR产物浓度,以便进行下一步的测序反应。

5PCR产物纯化

步骤如下:

150ul去离子水到纯化板的孔中,室温放置5min润膜.

2PCR产物,加到纯化板的孔中。33000g离心1015min,直到把液体全部离出。450ul去离子水,重复离心一次,确保把PCR产物洗干净。5加适量的去离子水,室, , , , , , , , , , 温放置1015min,回溶DNA。分装到96PCR板中,4度保存备用。

(6)测序反应

采用末端终止法进行测序,所使用的染料主要为BigDye.具体程序如下:1 96度预变性3min2 96度变性10sec60度退火3min(25cycles)4度保存

测序产物纯化

1】测序产物中加入95%乙醇及7.5mmol/l乙酸铵混合液(95%乙醇: 7.5mmol/l乙酸铵=30:1,-20度放置5min【加混合液算法:(a+b)×70%=b×95%,a为测序反应体系,b为乙醇:乙酸铵混合液的体积】。

2】用SORVALLrLEGEND RT离心机,于4300rm4度离心30min,弃去上清液。

3】加70%乙醇30ul,于4300rpm4度离心15min,弃去上清液,室温干燥2030min

上机测序

向纯化好的测序产物内加入8ul上样缓冲液,进行测序。

基因检测结果:

CYP2C9*3(Cys144/ Leu359)是外显子71061位核苷酸A突变为C, 导致多肽链第359IleLeu取代。而VKROC1基因上游启动子存在有一个-1639G>A 变异位点。CYP2C9*3A1061C经引物设计后扩增出长约100bp片段。VKROC1G-1639A经引物设计后扩增出长约95bp片段。电泳结果见图

1 CYP2C9*3 A1061C    2VKROC1 G-1639A

CYP2C9*3 A1061C各基因型测序图

AA

AC

CC

VKROC1 G-1639A各基因型测序图:

AA

AG

GC

Hardy-Weinberg遗传平衡检验:

156例患者中,VKORC1-1639AA64.2%,AG29.5%,GG6.3%CYP2C91061AA61.4%AC34.1%CC4.5%。经检验两种基因型分布频率观测值与预计值差异不显著,符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P均大于0.05),说明样本来自一较大,处于随机分配婚配的群

体。具有一定代表性。

 

一、整理一般患者临床资料:

病人资料共86例,其中男性患者41例,女性患者45例,服用国产华法林患者62例,进口华法林患者24例,高血压患者35例,年龄大于75岁以上27例,心衰18例,脑卒中患者9例,体重超重者32人,糖尿病11例,控制心率45人。以初始剂量2.5mg/d为标准,将服用1日后所测及随后2INR值按2.0以下为低敏组,2.03.0范围为正常组,3.0以上为高敏组。将以上资料分别进行单因素分析。

二、服用华法林的房颤患者的影响因素的单因素分析(分类变量资料的Χ2检验)

1.高敏组与正常组临床资料的比较

结果显示:1高敏组与正常组相比,年龄构成比高于正常组,体重指标低于正常组,差异有统计学意义。2而在基础疾病,控制心率,性别,脑卒中,,华法林J方面无明显差异,差异无统计学意义。

2.高敏组与低敏组临床资料的比较

结果显示:1高敏组年龄指标高于,体重低于低敏组,差异有统计学意义。2两组在基础疾病,控制心率,性别,脑卒中方面差异无统计学意义。3高敏组华法林J构成比高于低敏组,但差异无统计学意义。

3低敏组与正常组临床资料的比较

结果显示:1正常组的年龄,指标均高于低敏组,体重指数低于低敏组,差异有统计学意义2两组在基础疾病,控制心率,性别,脑卒中,华法林J方面差异无统计学意义。

4将高敏组及低敏组,正常组临床数据比较

结果显示:1高敏组年龄,体重指标均高于正常组及低敏组,而正常组年龄,体重指标又高于低敏组,差异有统计学意义。2高敏组及正常组,低敏组基础疾病,控制心率,性别,脑卒中,华法林J方面差异无统计学意义

  1. 高敏组与低敏组基因分型比较

高敏组与低敏组比较:1高敏组CYP2C9(AA)基因型频率分布最多,CYP2C9(AC)型分布频率其次,而CYP2C9(CC)型分布最少,低敏组CYP

2C9(AC)型频率分布最多,CYP2C9(AA)型分布频率其次,而CYP2C9(CC)型分布最少。2高敏组VKORC1(AA)基因型分布频率高于低敏组,而低敏组VKORC1(AG)型和VKORC1(GG)型高于高敏组。3高敏组和低敏组的VKORC1-1639型和CYP2C91061型各个基因亚型分布频率存在显著差异,差异有统计学意义

2正常组与低敏组基因型比较

低敏组与正常组比较:1正常组CYP2C9(AA)基因型分布频率最高,其次分别 是低敏组CYP2C9(AC)CYP2C9(CC)型。2 VKORC1(AA)型在正常组分布频率最高,而VKORC1(AG)VKORC1(GG)分布较少。3低敏组的CYP2C9(AA)型和VKORC1(AA)型分布频率均低于正常组,但CYP2C9(AC)CYP2C9(CC)型,VKORC1(AG)VKORC1(GG)分布频率均高于正常组。4低敏组与正常组在VKORC1-1639型和CYP2C91061型各个基因亚型分布频率存在显著差异,差异有统计学意义

3高敏组与正常组比较

高敏组与正常组相比:1高敏组CYP2C9(AA)VKORC1(AA)基因型构成比均高于正常组,而CYP2C9(AC)CYP2C9(CC)分布频率及VKORC1(AGVKORC1(GG)分布频率则低于正常组。2高敏组和正常组在VKORC1-1639型和CYP2C91061型各个基因亚型分布频率存在差异,差异有统计学意义。

4.高敏组与正常组,低敏组基因型比较

高敏组,正常组和低敏组比较:1、高敏组与正常组,低敏组3组基因型比较: CYP2C9106VKORC1-1639基因型在3组中呈以下特征分布:CYP2C9(AA)VKORC1(AA)型在高敏组分布频率最高,在正常组分布居中,低敏组分布最少。而CYP2C9(AC)CYP2C9(CC)VKORC1(AG)VKORC1(GG)在低敏组分布频率最高,在高敏组分布最少,在正常组分布居中。23组在CYP2C9106VKORC1-1639基因亚型构成比上均存在差异,且差异有统计学意义。

三、服用华法林的房颤患者的影响因素进一步分析

VKORC1-1639型和CYP2C91061型有3个基因等位点,需消除各基因组间性别,年龄等混杂因素的影响。故依据基因型分组,比较其年龄,体重,与INR维持剂量。结果显示各基因分组间体重,年龄无统计学差异。对华法林的维持剂量做变异系数分析(ANOVA, CYP2C9*3 A1061CAC基因型华法林维持剂量为(5.33+2.27)明显低于AA型(7.33+1.87mg/d,AC基因型华法林维持剂量明显高于CC型(3.32+1.75mg/d)。对于VKORC1-1639基因型,基因型AA最高(8.39+1.67mg/d),AG基因型居中(5.46+1.37mg/d),GG型基因最低。VKORC1-1639型和CYP2C91061型对华法林维持剂量均有影响。

1.CYP2C9-1061各基因型间临床资料比较

AA

AC

CC

Χ2

P

体重(KG

49.23+7.32

52.41+4.27

56.87+6.72

0.176

0.766

年龄(岁)

65.2+5.32

63.2+4.78

60.52+3.28

0.276

0.978

INR

2.42+0.32

2.28+0.26

2.36+0.24

0.581

0.643

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2.VKORC1-1639
各基因型间临床资料比较

AA

AG

GC

Χ2

P

体重(KG

46.34+8.13

48.31+6.31

51.5+7.25

0.103

0.974

年龄(岁)

66.7+5.12

64.53+5.21

61.84+4.65

0.201

0.864

INR

2.31+0.31

2.28+0.27

2.36+0.28

0.127

0.821

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3.CYP2C9-1061
VKORC1-1639各基因型组合的方差分析(ANOVA

SNP

基因型

维持剂量mg/d

检验结果

A1061C

AA

7.33+1.87

F=15.8

AC

5.33+2.27

P<0.01

CC

3.32+1.75

G1639A

AA

8.39+1.67

F=18.1

AG

5.46+1.37

P<0.01

GG

4.21+1.31

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CYP2C9-1061
方差分析图

VK0RC1-1639方差分析图

四、多元回归分析

由于华法林的抗凝作用受多因素影响。用X2检验等单因素分析所得结果可能片面且难以综合,故将单因素分析中具有显著差异性的影响因子进行多元线性回归分析。

将样本进行多元线性回归分析,推算出华法林维持剂量模型,将患者的年龄,体重,基因差异等因素作为自变量,维持剂量的平方根(D)作为因变量(因为因变量=D,偏态分布,故进行平方根数据转换)做多元线性回归分析:D=1.8450.07(年龄,岁)+0.07(体重,Kg)+0.402VKORC1G1639A)+0.092(CYP2C9A1061C),其中,VKORC1G1639AA=0AG=1,GG=2. CYP2C9A1061AA=0AC=1.CC=2。此回归模型中判断系数的平方(R2=0.262.回归方程显著性检验(F检验)F=19.8P<0.01,各自变量的回归系数检验(t检验)。P均小于0.005

因素

回归模型

P

R2

年龄,体重,CYP2C9A1061

D=1.8450.07(年龄,岁)+0.07(体重,Kg)+0.092(CYP2C9A1061C)其中AA=0AC=1.CC=2

<0.01

0.13

年龄,体重,

VKORC1G1639A

D=1.8450.07(年龄,岁)+0.07(体重,Kg)+0.402VKORC1G1639A

其中, AA=0AG=1,GG=2.

<0.01

0.45

年龄,体重,

VKORC1G1639A

CYP2C9A1061

D=1.8450.07(年龄,岁)+0.07(体重,Kg)+0.402VKORC1G1639A

0.092(CYP2C9A1061C)

<0.01

0.52

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房颤是临床常见的心律失常,其发病律随年龄的增加而增加,血栓栓塞是房颤的严重并发症之一,与健康对照组相比,非风湿性房颤患者有5.6倍栓塞风险,风湿性房颤患者有17.6倍栓塞风险[11]。虽然目前可通过射频消融术治愈部分房颤患者,但其手术费用昂贵,复发率高。而通过左心耳切除和封堵的方法预防血栓,但此项技术仍不很成熟,大规模运用于临床尚需时间。目前药物治疗仍是预防血栓栓塞的最重要措施。大规模临床试验证明华法林是减少房颤患者血栓栓塞事件的有效药物。对有血栓栓塞风险的房颤患者常规进行华法林抗凝治疗已经成为临床医生的共识。

尽管口服华法林抗凝,使INR值达到23能有效降低脑卒中的危险,但由于华法林自身存在的问题,限制了华法林的临床应用。1有效治疗范围小,为达到治疗范围,减少出血并发症,常需要频繁检测INR值,进行计量调整,致使很多患者依从性差,达不到充分的抗凝效果。2不能预测有效剂量。3需要数天或数周时间才能达到稳定的INR水平。4INR值受到众多药物及食物的相互作用,难以维持稳定的INR水平。

近年来,新型凝血酶抑制剂——Ximelagatran(希美加群)问世,三期临床研究SPORTIF-Ⅲ显示该药抗凝效果与华法林相似。一般用法为36mg,每日2次,口服吸收快,与食物无相互作用,代谢不依赖肝细胞P450色素酶系统,与其他药物相互作用可能性小。可固定剂量,不需要抗凝检测[12-15]。这使人们最初对该药寄予厚望,但是在后来的研究中,3例患者出现了致命性肝损伤,定期肝功能检测也不能减轻肝功能损害的风险,因此美国食品和药品管理局停止了Ximelagatran的所有临床研究,并拒绝承认这一药物[16]。而其他新型抗凝药如艾比沙班(Apixaban)达比加群酯(Dabigatran etexilate)仍处于临床前期研究中,未真正进入临床大规模抗凝应用中[17-18]。虽然从长期来看,口服简便,不需检测的新型抗凝药替代华法林是大势所趋,但是目前华法林的抗凝地位仍不可动摇。

华法林作为一种香豆素类维生素K拮抗剂,存在S型华法林(右旋华法林)和R型华法林,S型华法林是华法林的主要成分,在肝脏中由细胞色素P450同工酶家族2亚家族C多肽9CYP2C9)代谢。维生素环氧化物还原酶复合物亚基1VKROC1)是维生素K循环的关键酶,华法林通过抑制VKROC1活性,阻断维生素K作为辅因子参与的将维生素K环氧化物转化为维生素K的羧化过程,抑制了凝血因子27910的活性,从而发挥抗凝作用。据目前研究表明:CYP2C9VKROC1的核苷酸多态性(SNP)对于华法林的使用剂量发挥着重要影响作用。CYP(细胞色素酶P450)是一组涉及到许多内外源物质的单加氧酶,位于细胞内质网膜上的CYP蛋白由CYP基因超家族编码。最大的CYP2家族在人类又可分为AF6个亚家族。迄今为止已分离出6CYP2C的环状基因结构。其中包括CYP2C9CYP2C9蛋白由491个氨基酸残基组成,是一种膜结合蛋白。在哺乳动物中此基因超家族至少含有10个家族,全长约为55kb,有9个外显子和8个内含子。目前发现CYP2C919个等位基因,分别为CYP2C9*2CYP2C9*19[19-20]。目前发现CYP2C9*2CYP2C9*3与华法林的使用剂量有关,CYP2C9*1是野生型(Arg144/ Ile359)编译正常的酶,CYP2C9*2(Cys144/Ile359)是外显子3416位核苷酸C突变为T,导致多肽链第144位的Arg Cys 取代。CYP2C9*3(Cys144/ Leu359)是外显子71061位核苷酸A突变为C, 导致多肽链第359IleLeu取代[21]。这两个位点的变异型都与个体所需华法林维持剂量偏低,达到稳定维持剂量的时间长,抗凝起始阶段出血风险增高有重要关系。其他变异位点目前未发现与华法林有相关作用。

CYP2C9*2CYP2C9*3的频率在不同人群种族中有很多差异。总体来说白种人的突变率高于黄种人与黑种人,而一些突变体只存在于特定人群及种族中,在白种人及土耳其人种中,三分之二的个体是野生型纯合子(CYP2C9*2),三分之一的个体是杂合子(CYP2C9*2CYP2C9*3),在美国黑人及东亚人群中未发现CYP2C9*2等位基因,95%为野生型纯合子[22-23]。国内除新疆地区维吾尔族检测到CYP2C9*2等位基因(频率为3%,其他文献均未报道亚洲地区黄种人群中检测出CYP2C9*2等位基因[24]。在中国人群中,不同地区CYP2C9*3的频率不同,唐和年等针对新疆维吾尔族 人群研究中发现二者的发生频率依次为0.030.17[25]。何震宇等针对广东人群的研究发现CYP2C9*2CYP2C9*3突变等位基因的发生频率为:00.03。这与本研究的结果相似[26]

但是,迄今为止,所发现的CYP2C9只能部分解释个体之间华法林所需剂量的差异,而不能解释种族之间的这种差异[27]。近年来国外把研究研究影响华法林剂量的基因差异的重点转移到了VKROC1上,而VKROC1作为华法林作用的靶基因,目前研究较多的为-163G-A,-1173C-T两个突变位点。Hsiang-YuYuan等人发现VKROC1基因上游启动子区域有一个-163G>A 变异位点,并发现-163 AA基因型的个体所需华法林剂量最小,而GG基因型最多。他们同时分析了中国人与白种人所需华法林剂量的差异:中国人群中-163 AA基因型占人口大多数,而在白种人群中AGGG基因型占人口大多数,所以中国人平均所需华法林剂量要比白种人小[28]。其他学者也对该多态性位点进行了研究,并指出华人AA型基因频率高于欧洲人群是华人华法林维持剂量低于欧洲人群的主要原因,这与Hsiang-YuYuan等学者的结论是一致的[29]Anderea等人对VKROC1基因多态性与华法林剂量的个体差异也进行了研究,他们在VKROC1基因内含子1上发现-1173C>T 突变与华法林剂量的个体差异有密切关系,在1173CC基因型的人群中华法林的使用剂量要比CC型和TT型高[30]。另一项研究表明:-163G>A在高加索人与中国人突变等位基因发生频率分别为0.860.20. -1173C>T在高加索人群中突变等位基因发生频率为0.2[31]。由此可见VKROC1基因-163G>A-1173C>T多态性不仅可以解释个体间华法林维持剂量的差异,也可以解释不同民族之间的这种差异。

2001年马量等人报道了CYP2C9A1061C基因与华法林耐药及出血并发症的关系,并认为CYP2C9A1061C基因的变异会减慢华法林的代谢,患者易出现出血并发症,故患者应用华法林的剂量应减少[32]。但有关中国大陆人群这两个基因多态性与华法林关系研究尚处于开始阶段,基于这种情况,本实验对上述两个基因型频率进行研究。

本研究证实了HasiangYuYuanJinJerChen等关于中国汉族人群VKROC1-1639基因型以AA居多,AGGG型较少见的报道。可见西方高加索人群的VKROC1-1639基因以AG型为主,GG型次之,AA型最少。    而我国汉族人群与之相反。

但我们研究发现国人VKROC1-1639AGGG型分布频率为29.5%6.3%,要高于HasiangYuYuanJinJerChen等人的报道的香港华人(18.3%1.9%),CYP2C91061AAACCC型分布频率分别为:0.6140.3410.045,等位基因C频率为0.386,比国外文献报道的中国汉族人等位基因C频率在25%[33]之间要高。原因可能是因为研究对象的样本含量不同照成的。HasiangYuYuan等人的样本含量为104人,而我们的样本含量要少于他们。也可能是因为我们的研究都来自云南地区人群。对大陆地区华人的代表性不高。2005Giovanna D Anderead等人报道西方人群CYP2C91061AAACCC3种基因型频率分布分别为8316.30.7,本研究结果提示我国汉族人群CYP2C91061 AC变异频率与西方人群差异不大。

国外有文献报道INR值控制在23时,华人华法林维持剂量(3.3mg)比白人(6.1mg)要低约50%[34]。有学者指出民族因素是影响华法林剂量的决定因素。本研究发现VKROC1-1639GACYP2C91061 AC转变均明显减少华法林用量,VKROC1-1639AG型的患者华法林用量GG型降低低11.1%,而AA型要比AG型下降7.2%,CYP2C91061CC型的个体化华法林用量比AC型的用量要比AC型的低14.5%,AC型又比野生纯合型低7%

在去除体重,年龄因素的影响,并进行两基因各基因型分组分析后,本研究结果仍提示VKROC1-1639GACYP2C91061 AC转变与华法林应用剂量降低。即VKROC1-1639基因型一样时,随着CYP2C91061 AC转变,个体所需华法林维持剂量随之降低,且携带两个C等位基因的个体剂量比携带英国C等位基因的个体低;同样在CYP2C91061基因型固定时,随着VKROC1-1639GA转变时,个体所需华法林维持剂量随之增大,且携带两个G等位基因个体所需剂量要比携带一个G等位基因的个体大。结合文献报道的有关这两个基因多态性分布的种族、地域差异分析,因为我国汉族人群VKROC1-1639基因型分布与国外相反,以AA型占多数。而CYP2C91061基因型分布频率分布与西方人群相差不大且变异频率小,以此推测VKROC1-1639基因多态性可能是决定我国汉族华法林用量的重要影响因素之一,也是我国人群与西方人群华法林维持剂量存在巨大差异的重要原因,当然此推测还有待更大样本的实验来证实。

有载脂蛋白E(ApoE)作为一个含有199个氨基酸的糖蛋白,存在于乳糜蛋白(CM),低密度脂蛋白(LDL),极低密度脂蛋白(VLDL)及高密度脂蛋白(LDL)中。对肝脏摄入维生素K起重要作用。人类的ApoE共有3种主要亚型:E2E3E4.在中国汉族人群中这3种亚型等位基因发生频率分别为:0.09,0.82,0.09[35]Kohnk等的研究纳入了183CYP2C9非单一化的患者,发现ApoE*E4纯合患者华法林剂量为每周56.9毫克,明显高于仅携带一个或不携带E4亚型的患者(每周34.3毫克和34.6毫克)。而Sconce等的研究则显示携带ApoE*E4的患者平均日剂量较低于其他基因型患者。且与CYP2C9VKROC1相比,ApoE基因多态性与华法林维持剂量的相关性较小。(R=57)该研究提示单独分析ApoE的基因多态性对于华法林的维持剂量的预测可能不具有显著的临床意义[36]。目前ApoE多态性与华法林维持剂量的相关性的研究结果仍不一致,存在争议。其他如Y-谷氨酸羧化酶(GGCX),多药耐药基因(MDRI),内质网伴侣蛋白(CALU)等基因多态性也被列为相关的研究中。但目前研究结果表明单独分析它们的基因多态性与华法林剂量的相关性往往不具有显著临床意义。

华法林药物基因组学正在从单基因多态性研究向多个基因多态性协同研究转变。同时也是从单纯的理论研究转向通过基因多态性研究并构建华法林维持剂量群体模型的研究,最终实现以基因导向的华法林个体化用药。华法林多个基因多态性协同研究更有助于阐明华法林维持剂量的差异。维持剂量模型的建立使药物基因组学应用于临床的进程又前进了一步。

Miao等针对中国人群的研究中,纳入了178例华法林维持剂量稳定且INR值控制在目标范围内(1.53.0)范围内的患者。结合CYP2C9VKORC1基因、年龄和体重模拟了多重回归模型:剂量=6.220.11(年龄+0.017(体重)-0.775CYP*3)-3.397VKROC1X1)-4.083VKROC1X2),其中VKROC1的基因型为AA,则在VKROC1X1VKROC1X2位置分别代入01,如果基因型为GA,则分别代入10,若基因型为GG,则分别代入00。该研究中纳入的上述4个因素联合起来可解释63%的华法林维持剂量变异[37]Sconce等的研究也利用相似的原理和方法进行了模拟,并选取了38例华法林抗凝治疗稳定的患者作为模型试验组,将模拟计算所得结果与实际维持剂量进行比较,维持剂量平均差异为0.20.8mg/d,r=0.80,P<0.01Wadelius等对201例患者进行了包括VKROC1CYP2C9在内的10个相关基因单核苷酸多态性的多重回归分析,所得回归模型可以解释76%患者的华法林维持剂量个体间差异,该结果也提示随着分析因素的增加可以使模型更加准确[38]。随着对华法林维持剂量模型研究的深入,模型的建立也开始针对不同适应症的患者。Millican等针对髋关节置换术后患者的研究中,将吸烟情况与术估计失血量等具有患者群体特征的因素列入模型的分析中,从而使模型更具有个体化意义[39]。尽管目前的华法林维持剂量模型仍需要更大规模的临床样本试验来验证安全性和有效性,但不否认多因素的多态性联合研究对华法林维持剂量个体化预测具有积极的临床指导意义。

临床数据(ClinicalData)公司已经推出了一种用于基因检测的产品PgxPredicT:WARFARIN,只需要采集少量指血即可在35天内获得患者的基因型检测结果,大大简化了基因检测的程序[40]。除此之外,华法林的药物基因组学的研究还具有可观的经济学价值。Williamd等的研究结果显示,将个体化基因检测引入到华法林的常规剂量的调整中,每年可减少85000例严重出血事件和17000例卒中事件,可节省约11亿美元的卫生保健费用[41]

 

1单因素分析年龄、体重因素、VKROC1-1639CYP2C91061INR值之间存在显著相关。

2性别因素对INR值无影响。

3单因素分析VKROC1-1639AA型个体所需华法林平均剂量比AG型低,AG型又低于GG型,CYP2C91061AC型个体需华法林平均剂量比AA型低,CC型则更低。

4联合基因分析:VKROC1-1639GACYP2C91061 AC转变与华法林应用剂量降低。即VKROC1-1639基因型一样时,随着CYP2C91061 AC转变,个体所需华法林维持剂量随之降低,且携带两个C等位基因的个体剂量比携带英国C等位基因的个体低;同样在CYP2C91061基因型固定时,随着VKROC1-1639GA转变时,个体所需华法林维持剂量随之增大,且携带两个G等位基因个体所需剂量要比携带一个G等位基因的个体大。

5结合两个基因多态性在我国汉族人群与西方白种人之间差异分析,因我国VKROC1-1639基因型分布以AA居多,AG型次之,GG型最少。而西方人群中以AG型和GG型居多,AA型最少。我国汉族人群中CYP2C91061基因型分型与国外差异不大。所以VKROC1-1639AA型占多数可能是中国汉族人群所需华法林维持剂量比西方人群普遍较低的原因。

问题与展望

本研究还存在以下问题:1由于影响华法林抗凝作用的影响因素太多,收集资料不够全面。很多药物及食物等混杂因素可能对研究结果存在干扰。2样本含量不足,研究的病例数偏少。3由于客观条件的限制只选取了两个具有代表性的基因多态性作为研究对象,未考虑其他基因组多态性对华法林抗凝作用的影响,结果不够用全面准确。

目前华法林相关基因多态性的研究大多数集中在白种人群及其他种族,但由于基因的遗传分布频率存在明显的种族差异。将外国人群的研究结果照搬到中国人群是不切实际的。阐明中国人群中华法林相关基因多态性与维持剂量的关系是迫切需要的,结合业务基因组学的研究结果建立适合中国人群的华法林维持剂量模型,对于更合理的使用华法林,减少栓塞、出血等不良事件风险具有重要的临床指导意义。为最终实现以基因为导向的华法林个体化用药提供依据。

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作者简介
韩明华
单位:云南省第二人民医院(云南大学第一临床医学院、云南省红十字会医院)
简介:韩明华教授,省二院心内科主任,硕导。中华内科学会委员,省心内医师分会副主委,获得“国务院津贴”。
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